绵羊卵母细胞的体外培养、受精与发育的观察

笔者等把屠宰母羊卵巢卵母细胞经体外培养成熟后用于体外受精,曾得到76.2—92.5％的受精率。本实验将体外成熟、受精后的羊卵在体外条件下继续培养或者在2—4细胞期移植给受体母羊之后,分别观察了培养卵的发育情况和移植羊的受胎率。     

HFSC标记在阿尔巴斯绒山羊毛囊及毛囊干细胞中的表达

旨在检测最广泛应用的毛囊干细胞标记在阿尔巴斯绒山羊毛囊组织中的表达情况,为今后内蒙古绒山羊毛囊组织学和细胞学领域相关研究提供依据。以阿尔巴斯绒山羊为研究对象,对其进行Krt15、Krt19、CD34和Sox9等的冰冻切片和细胞免疫组化实验。以上4个标记均在外根鞘中表达;Krt15、Krt19在隆突部表达,在隆突部下端不连续表达;CD34在隆突部和隆突部下端都有较强的表达;Sox9主要集中在隆突部表达。Krt15、Krt19、CD34和Sox9共同表达的部位为毛囊隆突部,因此可结合表达部位特征选用为阿尔巴斯绒山羊毛囊隆突部来源的毛囊干细胞鉴定标记。     

利用体细胞核移植技术制作人胰岛素原转基因牛 （英文）

通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。     

棉花品系Ｙ18对草甘瞵应激反应机理的研究

5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase, EPSPS）是植物和微生物体内合成芳香族氨基酸所必需的一个关键酶,但此酶受广谱性除草剂草甘膦的强烈抑制。本试验对草甘膦胁迫下的棉花品系（Y18）研究发现：棉花品系Y18具有两个不同的5-烯醇丙酮酰-莽草酸-3-磷酸合成酶基因epsps1和epsps2,两个基因的编码区与其他植物的epsps基因具有较高的同源性,在草甘膦胁迫作用下,棉花的epsps1基因表达较为稳定,epsps2基因表达提高了1.85-2.3倍,初步认为epsps基因表达量的提高是生物对胁迫作用的一种应激反应。     

构建LEF1基因毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞

旨在构建内蒙古白绒山羊(Capra hircus)淋巴样增强因子-1(Lymphoid enhancer factor,LEF1)基因真核表达载体并转染胎儿成纤维细胞,获得稳定表达红色荧光蛋白及毛囊特异性表达LEF1的转基因细胞克隆。以pCDsRed2载体为基本骨架将LEF1基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,连接红色荧光蛋白表达元件,构建LEF1基因毛囊特异表达载体pCDsRed-KL。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KL序列中,LEF1基因正确连接在KAP6-1启动子下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。脂质体介导的稳定转染效率约为14.0%,经G418筛选得到高效表达红色荧光蛋白转基因细胞克隆。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和LEF1基因整合到胎儿成纤维细胞基因组中。     

血清及BSA对牛体外受精胚胎发育过程超微结构影响的研究

本研究将牛IVF胚胎分别在SOF FCS、SOF BSA和SOF PVA三种培养系统内进行培养,然后分别取三个系统中发育到原核期、2细胞、4细胞、8细胞、桑椹胚和囊胚阶段的胚胎进行透射电镜的观察,了解培养系统中血清和BSA的添加与否对胚胎发育过程中细胞内脂滴、细胞连接、细胞凋亡和微绒毛发育的影响。观察结果表明：各培养系统胚胎的细胞质中均存在大量的脂滴,表明外培养系统是造成脂滴积累的主要原因;血清的添加不会进一步促进脂滴的大量积累,反而可以避免多个脂滴聚合成更大的脂滴。三种培养系统条件下胚胎细胞连接无显著差异。培养系统中添加FCS或BSA时,桑椹胚期以后的胚胎细胞中存在凋亡小体,表明血清成分是引起细胞凋亡的重要原因。培养系统中血清成分的缺乏会影响胚胎表面微绒毛的发育。     

白消安致大鼠无精子症模型的建立

目的:利用白消安建立SD(Sprague-Dawley)大鼠少精子症动物模型,为治疗人类男性不育症提供实验依据。方法:本研究取6周龄左右SD大鼠随机分为对照组和实验组,实验组通过腹腔注射不同浓度白消安(15、20、30、40、60 mg/kg体重),每个浓度分单次注射和连续10次累计注射两种方式,注射后每隔10d随机取样检测精子浓度、活力、畸形率以及曲细精管内部结构各项指标,30d出现弱精少精等不育症状后,第40d后停止取样,观察白消安对大鼠精子的作用效果。结果:单次注射15-60mg/kg剂量白消安都会使实验大鼠不同程度死亡,连续10 d累计注射剂量15 mg/kg白消安可破坏大鼠睾丸组织的部分精原干细胞,连续10 d累计注射总剂量20 mg/kg是较为理想的实验浓度,可消除全部精原干细胞和大部分支持细胞,30、40、60 mg/kg可致大鼠死亡或睾丸病变充血。结论:白消安对大鼠生殖细胞有毒害作用,通过腹腔注射一定浓度白消安可建立大鼠少精子症模型,可为外源干细胞体内转分化为生殖细胞提供准确的移植时间和实验依据。     

利用CRISPR/Cas9系统构建FGF21基因敲除小鼠模型

成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, FGFs)是细胞间的多功能信号分子,调节生物体的多种生理功能。FGF21作为一种重要的调控因子,对毛囊发育及生长周期具有重要作用。为研究FGF21基因对毛囊发育及生长周期的影响及作用机制,本研究通过构建靶向敲除FGF21基因的载体,体外将Cas9 mRNA和gRNA显微注射到FVB小鼠受精卵中,在小鼠FGF21基因的第1外显子上造成移码突变,从而获得FGF21基因敲除(knock out, KO)小鼠。通过测序鉴定F₀代小鼠基因型,共获得3只FGF21等位基因敲除小鼠(Fgf21 ^-/-);qRT-PCR和Western blotting结果表明,在Fgf21 ^-/-小鼠中未检测到FGF21 mRNA表达和FGF21蛋白表达;经脱毛再生及皮肤组织H&E染色发现,与野生型(wild type, WT)小鼠相比,Fgf21 ^-/-小鼠体重降低、器官组织未出现异常变化、毛发生长速度减慢、毛囊的直径和毛发的密度均减小。本研究利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Fgf21 ^-/-小鼠模型,为后续研究FGF21基因在毛囊发育及生长周期中的功能提供了更好的动物模型。     

Sox9在发育、成体组织和人类疾病中的研究进展

在软骨发生过程中基因突变引起骨骼畸形躯干发育异常。在患者体内首次发现了转录因子Sox9。随着后续研究,在胚胎发育中证明了Sox9是细胞命运决定因子。胚胎发育时期,Sox9能使不同胚层的细胞向特定的组织分化。最新的研究发现,在一些由内胚层和外胚层发育而来的成体组织和成体干细胞中Sox9仍表达。这表明Sox9在成体细胞维持和特化中起作用。Sox9功能多样性应结合转录后调控、结合蛋白、所表达的组织类型来解释。因其在胚胎和成体中的重要作用,Sox9异常表达会引发多种疾病。这篇综述总结了Sox9在细胞命运决定、干细胞学和人类疾病中的多种不同功能,希望对今后Sox9在干细胞失调或器官损伤引起的疾病治疗研究提供思路和依据。