Construction of a trivalent candidate Shigella vaccine strain with host-vector balanced-lethal system

A trivalent live Shigella vaccine candidate FSD01 against S. flexneri 2a, S. sonnei and S. dysen-teriae I was constructed. This candidate strain was based on the S. flexneri 2a vaccine T32. By homologous recombi-nation exchange, the chromosomal asd gene of T32 was site-specifically inactivated, resulting in the strain unable to grow normally in LB broth, while another asd gene of S. mutans was employed to construct an Asd complementary vector. This combination of asd 'host/ Asd vector formed a balanced-lethal expression system in T32 strain. By use of this system, two important protective antigen genes coding for S. sonnei Form I antigen and Shiga toxin B subunit were cloned and expressed in T32, which led to the construction of trivalent candidate vaccine FSD01. Experimental results showed that this strain was genetically stable, but its recombinant plasmid was non-resistant. Moreover, it was able to effectively express trivalent antigens in one host and induce protective responses in mice against the     

宋内Ⅰ相抗原和霍乱CT-B共表达的免疫保护效果观察

将编码宋内氏痢疾菌(Shigella sonnei)I相O抗原的基因和霍乱弧菌(Vibrio choler-ae)的CT-B基因克隆至带asd基因的质粒PYA248,得重组质粒PMGL105。将该重组质粒转入asd基因缺失的减毒伤寒沙门氏菌X4072,构成了一个不带抗药性基因的载体-宿主平衡致死系统。一系列实验表明,该重组菌X4072(PMGL105)能稳定地表达宋内I相O抗原和霍乱弧菌的CT-B抗原。小鼠免疫保护实验表明,该重组菌对有毒的宋内氏I相痢疾杆菌及霍乱弧菌的攻击均具有良好保护作用。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）突变体FrGGI的构建、表达及特性分析

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＬ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４～Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ⅰ型Ｆ区间连接序列ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ＦｒＧＧＩ在大鼠血浆中的半衰期延长了１５倍,并获得了ＰＡＩ－１抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。     

毒素源性大肠杆菌CFA/I、CS_3重组菌株的粘附力、免疫原性和保护性的研究

本研究采用可逆性肠结扎成兔腹泻(RITARD)动物模型检测了毒素源性大肠杆菌(ETEC)定居因子抗原Ⅰ(CFA/Ⅰ)和表面抗原3(CS_3)重组菌株的肠道粘附力、免疫原性和保护性。经肠道及口服接种时重组菌株对肠道均有较强的粘附力,与CFAs阴性宿主菌相比P<0.01。口服免疫家兔时,第四周血清抗体滴度达到高峰,分别为1∶9 000和1∶80 000;肠道免疫家兔后血清效价在第二周达到高峰,滴度分别为1∶8 000和1∶60 000。在抗体滴度高峰时进行ETEC野生株攻毒,结果显示口服组抗腹泻保护率为66.7％～75％,肠道组为50.1％～71.4％。攻毒后免疫家兔的排菌天数较对照组明显减少。     

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)突变体工程细胞株生物学特性分析

t-PA突变体工程细胞株FSGGI48形态与其亲代细胞CHO-dhfr相似呈多角形,类似上皮细胞。在MTX加压至5×10~(-6)mol/L时,少数细胞形态略变瘦长,但仍呈多角形,因此该工程细胞株形态正常。抗体中和抑制试验及纤维蛋白板80℃加热试验显示,FSGGI48细胞表达产物与st-PA的活性均能被抗t-PA抗体所抑制,而胰酶的活性则不被抑制,且二者在80℃加热的纤维蛋白板上均不产生溶解圈,胰酶则产生溶解圈,由此可知,该细胞株表达产物为特异的rt-PA产品。细胞无血清培养上清经FA-PA检测,亚克隆株表达水平为4000IU/10~6细胞/24h。分别测定冻存3个月后复苏和体外传代3个月以上细胞的表达水平,结果显示部分亚克隆细胞株表达水平下降,多数仍为3000-4000IU/10~6细胞/24h,说明细胞株稳定性好。裸鼠试验表明,该工程株活细胞、细胞DNA、纯化的细胞表达产物均无致瘤性。支原体检查结果为阴性。染色体分析显示,FSGGI48细胞与其亲代细胞(CHO-dhfr细胞)染色体数目相同均为20条,但均有不同程度不同类型的畸变。CHO-dhfr细胞畸变率为6%。该工程细胞的畸变率为15%-18%,在允许范围内。结果证明,t-PA突变体细胞株FSGGI48为性能优良的工程细胞株。     

CS3纤毛抗原表达调控机理的研究

CS3亚基结构基因的核苷酸序列分析表明,在其翻译起始位点的上游存在着rbs位点及原核启动子的—10区和—35区DNA序列。凝胶阻滞和启动报告基因表达的实验确证了CS3亚基结构基因具有自身的启动子(Ps),怛它的作用受其上游区域的抑制。核苷酸序列分析发现,在Ps—35区上游550bp和840bp处各存在一个富A-T簇。结合原核启动子的一般作用规律推知,CS3的表达可能受DNA结合蛋白型的正向调节因子的作用,互补实验结果表明cfaD基因不仅可消除上游区对Ps的抑制,而且可大幅度地提高Ps的启动能力。在分析表达调控的基础上获得CS3重组高效表达。同时提出了其表达调控模型。     

用原生质体转化技术构建含有大肠杆菌K88acLT-B和0149抗原基因的菌株

毒素源性大肠杆菌(ETEC）是可以引起幼畜腹泻 的致病菌,此类菌具有对宿主特异的起粘附定居作用 的菌毛,还有直接引起腹泻的肠毒素,目前已发现对热 敏感的肠毒素LT和对热稳定的肠毒素ST。在临床 中经常分离到的带有K88菌毛抗原的致病菌主要是 引起新生仔猪的急性腹泻,其发病、流行都比较快,是 新生仔猪死亡的一个重要原因,给畜牧业造成极大的 危害〔‘’。本实验室经过几年的研究,已经构建了具有 K88ac菌毛抗原和LT肠毒素B亚单位抗原的无毒菌 株,并已作为疫苗菌株应用于畜牧业中。但是考虑到 自然界野生型菌株生命力强,还具有多种不同的。抗 原,所以发展口服免疫的活菌苗有必要考虑上述因素。 这样当孕猪口服免疫活菌苗后,即可以产生更好的免 疫应答,刺激细胞和体液免疫系统,产生保护性伉体, 通过初乳给新生仔猪提供保护。本实验利用我们构建 的带有K88ac抗原和LT=B抗原基因的PMM085质 粒（待发表于生物工程学报,1987,和一株带有0149 抗原和K88ac抗原的野生型菌株,在用常规的Ca'十 处理受体菌转化未获成功后,又利用PEG诱导的原 生质体转化方法,把质粒PMM085转化到上述带有 014,抗原基因的野生型菌中,得到了带有K88ac,LT-B 和014,抗原基因的无毒菌株。可望此菌株能更好地 模仿自然感染致病菌株,在免疫中产生更好的预Vi作 用。     

活菌疫苗载体的研究与应用

目前在疫苗研究中,要求新型疫苗不仅能够激发高效持久的免疫应答,而且应易于接种、生产费用低。减毒或无毒的活微生物作为疫苗载体能够激起持久的系统和黏膜免疫反应,批量制备成本较低,且具有良好的安全性,近年来已成为疫苗研究领域的热点。本文综述了几种活菌疫苗载体,包括沙门氏菌、卡介苗、耶尔森菌等的研究状况及其在疫苗载体方面的应用。     

DNA微阵列技术在细菌感染后宿主反应研究中的应用

感染性疾病是病原微生物和宿主紧密相互作用的结果。深入理解宿主对病原微生物感染发生反应的分子基础是预防感染性疾病发生和组织损伤的必要条件。本文通过介绍体内、体外2种感染模型中宿主对细胞内和细胞外致病菌感染后的基因表达谱变化,简述了DNA微阵列技术在病原菌一宿主相互作用中宿主反应研究中的应用。