t-PA在哺乳动物细胞中的表达调控及高效表达

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)对纤维蛋白有较强的亲和力,可选择性溶解血栓而不引起全身出血倾向,所以是一种较理想的溶血栓药物。美国的重组t-PA已通过FDA批准,应用于临床,每年销售达数亿美元。国内上医,北大,南大及我所先后开展了t-PA在CHO细胞中的表达的研究,经多年努力表达水平约1～2μg(200～400IU)/10~6细胞/24小时,但该水平离中试生产尚有差距。     

毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6基因的克隆

通过构建人源毒素源性大肠杆菌野生株E519/66A大质粒的基因文库,成功地筛选出能表达定居因子抗原CS6菌毛的阳性克隆,初步确定了克隆DNA片段的限制性内切酶图谱。CS6抗原的编码和调控基因集中在一大小为4.6kb的DNA区段中,该片段能产生两种分子量大小不同、但抗原反应交叉的菌毛蛋白。本研究获得的CS6抗原阳性的重组菌株可用于人源ETEC多价疫苗的研制,克隆的基因片段亦可作为研究CS6菌毛蛋白基因表达及调控的基础。     

组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ,在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３′非编码区部分序列,并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比,有两处差异,其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ,并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点,但由于差异发生在密码子第三位,没有引起编码的氨基酸变化;其二是第１７７７位核苷酸残基（终止密码子后第４位核苷酸残基）为Ｔ而非Ｇ,使与终止密码子相隔３个核苷酸残基处产生了一个新的ＴＧＡ,与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比此处的ＢｓｔＮＩ切点也消失了。     

靠近5′端帽子的上游AUG不影响t-PA mRNA的翻译

大多数真核生物mRNA的翻译起始都符合Kozak提出的扫描学说,即40s小亚基携带相应的起始因子进入mRNA的5′末端,沿mRNA线性滑动,至第一个AUG起始密码处与60s大亚基结合,形成第一个肽键,然后进入肽链延伸阶段。本课题组所构建的重组质粒pMM 5065含人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)cDNA。序列分析证明,该质粒中t-PA起始密码子ATG的5′端序列为:AAGCTTGCATGCCTGCAGGTC ATG GAT……,可见转录后t-PA mRNA起妈密码子AUG的5′端还有一个AUG三联体(即上游AUG),形成一个较长的与t-PA框架不同的阅读框     

大肠杆菌肠毒素的基因融合及其免疫原性的研究

应用重组基因工程技术,将热敏肠毒素Ｂ亚基（ＬＴ－Ｂ）基因与含有部分前体的耐热肠毒素（ｐｒｏ－ＳＴ）基因融合在一起,构建了表达ＬＴ－Ｂ／ｐｒｏ－ＳＴ融合蛋白的重组质粒．该融合蛋白不仅保持结合神经节苷脂（ＧＭ１）的能力,而且具有热敏肠毒素和耐热肠毒素的抗原性．乳鼠实验证明,融合蛋白虽然含有野生耐热肠毒素,但不具耐热肠毒素的生物毒性．腹腔免疫和鼻饲免疫均能激发产生抗ＥＴＥＣ两种肠毒素的抗体．     

利用宿主-载体平衡致死系统构建志贺氏菌3价疫苗候选株

选择福氏2a志贺氏菌疫苗株T32为受体菌,通过基因同源重组交换技术,对其染色体asd基因进行定位突变,使之不能在LB培基上生长;同时利用链球菌asd基因构建Asd⁺的无抗药性互补载体,两者组成1套T32宿主载体平衡致死系统.进一步应用该系统克隆和表达了具有重要免疫保护功能的宋内I相O抗原基因和志贺氏毒素B亚单位基因(stxB),构建成福氏2a-宋内-StxB3价菌苗候选株FSD0l.结果显示:该菌株遗传稳定,重组质粒不需用抗生素选择,能有效表达3价抗原和产生针对上述3种野生型毒株的免疫保护反应.     

抑瘤素McDNA的克隆及表达研究

抑瘤素M（onecostatinM,OSM）是一种多功能的细胞生长调节因子．从PMA刺激后的U937细胞系提取总RNA,采用逆转录-PCR方法分离到了抑瘤素M的cDNA;将抑瘤素M的cDNA克隆到质粒pUC19中,筛选三个阳性克隆进行序列分析,与国外报导序列完全一致;将抑癌素M的cDNA克隆到质粒pBV220后再转化DH5a进行模拟表达,SDS-PAGE分析表明有OSM表达,表达量约占细菌总蛋白5％,经过初步纯化的OSM能明显抑制A375细胞的生长．     

CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的表达载体

CS3是肠毒素源性大肠杆菌的菌毛蛋白 ,是一种很强的免疫原 .利用CS3菌毛作为异源抗原决定簇载体 ,在计算机分析预测CS3亚基的抗原表位区、二级结构的基础上 ,运用PCR定点突变在CS3亚基结构基因中引入了SacⅡ酶切位点序列 ,插入霍乱毒素B亚基抗原表位CTP3的DNA序列 ,构建了表达CS3/CTP3的重组菌株 .电镜和免疫电镜观察证明 ,CS3/CTP3以杂合菌毛的形式存在于菌体表面 .SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了CS3/CTP3杂合蛋白的存在 .口服和腹腔注射免疫Balb/c小鼠 ,该重组菌株可诱发抗CS3和抗CTP3的双重免疫应答 .结果表明CS3可以作为表达异源抗原决定簇的表达载体 ,可望成为研制口服粘膜免疫多价疫苗的新型系统     

肿瘤坏死因子与其受体相互作用的计算机模拟研究

利用同源模建方法,以ＴＮＦＲ５５受体胞外区的晶体结构为参考模板,预测了ＴＮＦＲ７５受体胞外区Ｃｙｓ１８～Ｐｈｅ１４７片段的三维结构．根据Ｒ５５受体胞外区与ＬＴ相结合的复合物的晶体结构,预测了ＴＮＦ与Ｒ５５及Ｒ７５胞外区的复合物的三维结构,模拟了ＴＮＦ与受体之间的相互作用．由于ＴＮＦ与受体的作用形式是三聚体对三聚体,因此在模拟ＴＮＦ与受体相互作用时选择了包括一个非对称的ＴＮＦ三聚体和一个受体（Ｒ５５或Ｒ７５）单体的模拟系统．结合已有的突变体实验结果,利用计算机模拟分析手段,发现了一些ＴＮＦ突变体之所以具有受体选择性的三维结构基础和发挥了关键作用的氨基酸残基以及这些残基之间的主要作用形式．研究深化了对已有的突变体实验结果的认识,建立了不同的实验结果之间的内在关联,为以后有目的的新型突变体设计和实验研究打下了基础．     

CS3菌毛可以作为异源抗原决定簇的嵌合表达载体

CS3是肠毒素源性大肠杆菌的菌毛蛋白,是一种很强的免疫原。研究了利用CS3菌毛作为异源抗原决定簇载体的可能性。在计算机分析预测CS3亚基的抗原表位区、二级结构的基础上,运用PCR定点突变在CS3亚基结构基因中引入了SacⅡ酶切位点序列,插入编码霍乱毒素B亚基抗原表位CTP3的DNA序列,构建了表达CS3/CTP3的重组菌株。电镜和免疫电镜观察证明,CS3/CTP3以杂合菌毛的形式存在于菌体表面,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示了CS3/CTP3杂合蛋白的存在。口服和腹腔注射免疫Bal b/c小鼠,该重组菌株可诱发抗CS3和抗CTP3的双重免疫应答。结果表明CS3可以作为表达异源抗原决定簇的表达载体,可望成为研制口服粘膜免疫多价疫苗的新型系统。