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51.
利用人粒细胞集落刺激因子(hG-CSF)cDNA3′端非翻译区(3′-UTR)中存在的DraⅠ酶切位点,通过部分酶切与完全酶切,删除3′-UTR不同长度,构建了四种hG-CSFcDNA瞬时重组表达质粒。转染COS-7细胞后,生物活性测定结果提示,hG-CSFcDNA3′-UTR对其表达起负调控作用,其关键性序列位于紧接终止密码子TGA下游的65bp范围内,3′-UTR对hG-CSFcDNA表达的影响与转录水平的差别有一定关系。 相似文献
52.
通过DNA体外重组技术,以pET-3b为表达载体,构建了重组表达质粒pET-6R(B)和PET-6R(B)4,分别编码28kD的hIL-6R配基结合区片段及其53kD的二联体蛋白,并为酶切分析和DNA序列分析所证实。SDS-PAGE分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出28kD的蛋白rIL6R-28和53kD的rIL6R-53。重组蛋白分别占菌体总蛋白的45%和29%左右。重组蛋白主要以包涵体形式存在,Western印迹表明重组蛋白具有IL-6R的抗原性。 相似文献
53.
在大肠杆菌中,利用新构建的含T7g-10L RBS以及λ-PR启动子的新型原核表达载体,通过表达gag-pol基因片段,获得了具有天然序列的人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核心蛋白p24的高效表达。克隆的gag-pol基因片段在其阅读框架移位区域插入了4bp碱基,其表达的病毒蛋白酶在阅读框架上与gag一致,从而实现了对gag-pol融合蛋白的有效加工,产生成熟的核心蛋白p24及其它产物。重组p24以可溶形式存在,可以被抗p24的单克隆抗体特异识别。测定的N端8个氨基酸序列与从病毒纯化的p24完全一致。在使用硫酸铵沉淀后,采用两步离子柱层析,可将重组蛋白纯化到95%以上的纯度。结果表明,纯化的p24可以作为特异性很强的试剂而用于HIV感染的诊断及病情的预后,并可用于p24的生化及结构分析。 相似文献
54.
55.
将编码人单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的基因亚克隆到大肠杆菌表达载体pEX31A中,在大肠杆菌中表达出MS2/MCP-1融合蛋0白,该表达产物约占菌体总蛋白的15%左右,Westernblot检测表明,表达产物可与MCP-1抗体特异反应。采用琼脂糖平板法进行活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性,说明N端融合一段细菌蛋白对MCP-1有无趋化活性可能没有影响。 相似文献
56.
t-PA cDNA在CHO细胞中的高效稳定表达 总被引:1,自引:0,他引:1
我们曾报道t-PA mRNA非翻译区序列对其表达有明显的抑制作用,在此基础上,通过对5′-UTR及3′-UTR的改造,使t-PA在COS-7细胞中的表达水平提高30倍左右。将t-PA表达质粒用电击法转染中国仓鼠卵巢细胞二氢叶酸还原酶缺陷株(CHO-dhfr),经过混合加压及筛选,在CHO细胞中高效表达了t-PA,表达水平达到5000~6000 IU/10~6细胞/24hr。重组t-PA具有与天然t-PA相同的分子量及酶活性。经过8个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的,其主要指标均符合工程细胞株的要求。 相似文献
57.
本文以人分裂细胞核抗原(PCNA)基因作为目的基因,把包括PCNA基因5′端非翻译区(5′NTR)的24bp和编码38个氨基酸114 bp的顺序插入pTZ19R,构建与LacZ’5′端的融合基因。用寡核苷酸定点突变法在PCNA 5′NTR形成SD顺序,再用PCR法在SD顺序左右两侧分别随机突变6个和7个碱基,使它们与结构基因5′端顺序自发地形成各种可能的翻译起始区(TIR)二级结构。重组质粒转化JM109(DE3),以T7 RNA聚合酶-T7启动子调控转录。对288个重组子的β-gal活性测定表明,不同重组的表达量可相差55倍,其中9个表达量不同的重组子的RNA dot blot证实它们在转录水平无明显表达差异。由此提示,该研究策略和方法能有效地改变目的基因的TIR二级结构和捕获具有高翻译起始效率的表达克隆。 相似文献
58.
通过直接凝集试验、免疫荧光试验、SDS-PAGE和Western印迹,对一株猪源性大肠杆菌的粘附素进行了研究.结果表明,该菌株是一株同时表达987P和F_(41)两种粘附素抗原的猪源性大肠杆菌. 相似文献
59.
旋毛虫肌幼虫ES抗原的基因克隆及高效表达 总被引:7,自引:0,他引:7
作者对编码旋毛虫肌幼虫ES抗原的部分结构基因进行了克隆、鉴定和表达。用RNA PCR技术直接从旋毛虫肌幼虫总RNA中反转录并扩增出0.7kh的靶DNA,酶切分析后将其克隆到融合表达载体pEx3lC中。SDS—PAGE电泳表明,含重组子的大肠杆菌能够表达出一分子量为37kDa的融合蛋白(P37),后者占菌体总蛋白的22%以上,并以包含体形式存在于菌体中。经对纯化后表达蛋白的ELlSA检测,证明它能被猪旋毛虫病阳性血清和抗旋毛虫单克隆抗体识别。研究结果揭示,重组蛋白P37对于研制旋毛虫病诊断抗原和免疫抗原具有潜在的应用价值。 相似文献
60.
利用基因工程技术,将质粒pYX382用xbaI和EcoRl切下插入的TGFa—PE40融合
基因片段-连接到可表达载体pCB604的XbaⅠ/EcoR Ⅰ位点中,构建成新的重组质粒p2x—TP1。P2x—TP1转化E.coli BL2l感受志菌后,在ⅠPTG诱导下Ⅰpp启动子转录表达TGFα—PE40融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式沉积在细胞内。融合蛋白表达量的高低与诱导时的细胞密度,诱导的温度以及培养基有关。在一定范围内与诱导剂的剂量以及诱导时间的长短无关。P2x—TPl重组质粒在工程菌中的表达TGFα-PE40融合蛋白量约为50mg/L。 相似文献