人白介素6受体功能区片段在E.coli中的表达

通过ＤＮＡ体外重组技术,以ｐＥＴ－３ｂ为表达载体,构建了重组表达质粒ｐＥＴ－６Ｒ（Ｂ）和ＰＥＴ－６Ｒ（Ｂ）４,分别编码２８ｋＤ和ｈＩＬ－６Ｒ配基结合区片段及其５３ｋＤ的二联体蛋白,并为酶切分析和ＤＮＡ序列分析所证实,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,含有重组表达质粒的菌株可分别表达出２８ｋＤ的蛋白ｒＩＬ６Ｒ－２８和５３ｋＤ的ｒＩＬ６Ｒ－５３重组蛋白分别占菌体总蛋白的４５％和２９％左右,重组蛋白主要包涵体形     

丙型肝炎病毒非结构区NS4b基因片段的克隆和表达

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术和ＤＮＡ体外重组方法,克隆出５７９ｂｐ的丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ４ｂ基因片段,插入到原核高效表达载体ｐＥＴ－２８ａ中,构建重组质粒ｐＥＴ／ＮＳ４ｂ,转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,经ＩＰＴＧ诱导培养后,获得了目的蛋白的高效表达。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示在３０ｋＤ处有一条表达的目的蛋白区带。通过固定化金属配体亲和层析（ＩＭＡＣ）纯化目的的蛋白,ＥＬＥＳＡ检测结果表     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组ＤＮＡ,用ＰＣＲ的方法扩增ｚｏｔ基因。序列分析表明,ｚｏｔ基因编码３９９个氨基酸,其中４个氨基酸与文献报道有差异。将ｚｏｔ基因插入含Ｔ７启动子的质粒ｐＥＴ－２８（ａ＋）构建表达质粒ｐＥＴ－ＺＯＴ,转化大肠檑菌ＢＬ２１（ＤＥ３）筛有达菌株ＢＬＺＯＴ。表达菌株经１ｍｍｏｌ／ＬＴ ＩＰＴＧ诱导表达３－５ｈ后,表达大量ＺＯＴ蛋白,并形成包涵体,经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析重组ＺＯＴ蛋白分     

芝田硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用ＰＣＲ 方法从芝田硫化叶菌中扩增了编码一种新酶,即麦芽寡糖基海藻糖合酶（ ＭＴＳａｓｅ） 的基因,扩增的２－２ｋｂ ＤＮＡ 插入到原核表达载体ｐＢＶ２２０ 中,构建成重组质粒ｐＳＢＧＴ１ 。ｐＳＢＧＴ１ 中ＭＴＳａｓｅ 基因在大肠杆菌中得到表达。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析表达产物ＭＴＳａｓｅ蛋白的分子量约为７４ｋＤａ ,同核苷酸序列测定所推导的值相符。表达产物占细胞总蛋白约４－４ ％ 。ｐＳＢＧＴ１ 产生的重组酶作用于淀粉部分水解物,使ＤＥ 值降低,得到非还原糖或低还原糖。     

日本血吸虫26kD抗原基因在BCG中的表达

研究了外源基因日本血吸虫２６ｋＤ抗原（Ｓｊ２６ＧＳＴ）在卡介苗（ｂａｃｉｌｕｓＣａｌｍｅｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ,ＢＣＧ）、耻垢分枝杆菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）和大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中的表达．运用重组ＤＮＡ和聚合酶链反应（ＰＣＲ）等分子生物学技术,以表达Ｓｊ２６ＧＳＴ的Ｅ．ｃｏｌｉｐＧＥＸ衍生质粒为模板,经ＰＣＲ得到编码Ｓｊ２６ＧＳＴ的全长ｃＤＮＡ片段．将其按正确的阅读框顺序,克隆到人结核杆菌热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎ,ＨＳＰ）７０的启动子下游,再将ＨＳＰ７０启动子和Ｓｊ２６ＧＳＴ基因一起亚克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭质粒ｐＢＣＧ－２０００中,得到Ｅ．ｃｏｌｉ－分枝杆菌穿梭表达质粒ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６．ｐＢＣＧ－Ｓｊ２６电转化入ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓｍｃ２１５５中表达Ｓｊ２６ＧＳＴ抗原,所表达的天然重组Ｓｊ２６ＧＳＴ（ｒＳｊ２６ＧＳＴ）为可溶性蛋白,在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上分子量为２６ｋＤ处可见明显的表达蛋白带．其表达量分别占ＢＣＧ和Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ菌体总蛋白的１５％和１０％．可见,Ｓｊ２６ＧＳＴ基因能在ＢＣＧ中高效表达．     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长为１７７５ｎｔ,其中包含３个开放阅读框架,分别编码２５ｋＤ蛋白、４．６ｋＤ蛋白和一种由５９个氨基酸组成的Ｎ蛋白。与法国Ｆ２分离物、德国Ｇ１分离物和日本Ｓ分离物相比,其核苷酸序列的同源性分别为９６．４％、９６．８％和９７．３％。将２５ｋＤ蛋白编码基因克隆到ｐＪＷ２上,构建了该基因的原核表达载体。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｉｎｇ分析结果表明,２５ｋＤ蛋白基因在Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中经温度（４２℃）诱导后,可特异地表达２５ｋＤ蛋白     

人Mn—SOD cDNA的克隆及高效表达

用逆转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）,以人肝细胞株（Ｌ０２）总ＲＮＡ为模板,扩增了人锰超氧化物歧化酶（ｈＭｎ－ＳＯＤ）的ｃＤＮＡ。重组到Ｔ７启动子控制下的表达载体ｐＥＴ－２４ａ（＋）中,构建表爱质粒ｐＥＴ－ＭｎＳＯＤ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及蛋白质印迹分析表明,经１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代－β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后,可高效表达一分子量为２２ｋＤ的蛋白质,与抗人     

大肠杆菌cai DE的基因克隆与表达

从Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＣ４１００菌体的染色体ＤＮＡ中利用鸟枪法克隆含编码肉碱消旋酶及相关因子的ｃａｉＤＥ基因片段,并经序列分析验证,由重组质粒ｐｌＸ３９３亚克隆得到ｐＤＳＷ２重组表达质粒,后者转入Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株中是丙基硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导,在聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）上分子量为３０ｋＤ和２４ｋＤ附近可见明显的表达蛋白带。     

人NMT的表达,纯化和活性研究

利用ＰＣＲ技术并进行ＤＮＡ序列测定,从人脑ｃＤＮＡ库中扩增得到人豆蔻酰ＣｏＡ蛋白Ｎ端豆蔻酰转移酶的编码基因,构建其在Ｔ７启动子控制下的成熟型和Ｈｉｓ６融合型的表达质粒ｐＭＦ－ｈＮＭＴ３和ｐＭＦＨＴ－ｈＮＭＴ２。转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,进行ＩＰＴＧ诱导表达研究。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析结果显示,在３７℃条件下表达的各种重组ｈＮＭＲ几乎全是不溶性产物,但在较低温度条件下表达的Ｈｉｓ６－ｈＮＭＲ绝大     

小麦黄花叶病毒RNA228kDa蛋白基因的表达及表达产物抗血清的制备

根据小麦黄花叶病毒（ Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ） 核苷酸序列测定结果,将 Ｗ Ｙ Ｍ Ｖ Ｒ Ｎ Ａ２ 上的２８ ｋ Ｄａ 蛋白基因克隆到ｐ Ｅ Ｔ１１ａ 上,构建了原核表达载体ｐ Ｅ２８３９ 。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 分析表明,经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导,２８ ｋ Ｄａ蛋白基因在大肠杆菌 Ｂ Ｌ２１（ Ｄ Ｅ３）ｐ Ｌｙｓ Ｓ 中得到高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,首次制备了小麦黄花叶病毒 Ｒ Ｎ Ａ２ 蛋白特异性抗血清。     

重组人白介素6受体功能区片段的功能鉴定

用生物素标记重组人白介素6受体功能区片段rIL6R-28及其二联体蛋白rIL6R-53．竞争ELISA表明重组蛋白可以与配基IL-6特异结合．流式细胞术检测结果表明IL-6与生物素标记的重组蛋白所形成的复合物能够与7TD1细胞表面的gp130结合．而7TD1细胞生长分析则表明,重组蛋白可以增强IL-6对7TD1．细胞的生长刺激作用．     

人工锌指核酸酶的设计与表达纯化

设计表达了四个锌指核酸酶,用于切断人基因组中的rRNA基因家族的内部转录间隔序列,造成双链断裂,以此提高针对多位点基因打靶的效率,为后续基因打靶应用于基因治疗研究奠定基础。首先,在人rRNA基因家族ITS1序列中找到两个合适的9 bp长的序列(中间间隔6 bp)为锌指蛋白识别位点,根据识别位点序列每个位点分别设计两个三锌指蛋白。通过设计引物进行重叠延伸PCR得到全长编码锌指蛋白的DNA,分别克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFP,转化大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指融合蛋白的表达与纯化。同时,将限制性内切酶Fok I的切割结构域分别与四个锌指蛋白序列采用PCR拼接后克隆到表达载体pET-28a（+）,构建重组质粒pET28a-ZFN,转化到大肠杆菌RossettaTM（DE3）,实现带组氨酸标签的锌指核酸酶融合蛋白的表达并纯化。     

嗜水气单胞菌溶血素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性分析

根据嗜水气单胞菌溶血素保护性抗原基因序列(GenBank Accession No. AF539467)设计一对引物, 以嗜水气单胞菌河北分离株基因组为模板, 经PCR扩增得到hly基因。序列分析表明, 该基因产物大小为1485 bp, 经测序与GenBank报道的多个嗜水气单胞菌hly基因序列一致性高于99%。将得到的hly基因定向克隆到原核表达载体pET-28a中构建原核重组质粒pET-28a- hly, 转化大肠杆菌 BL21(DE3)中, 得到重组菌株BL21(DE3)(pET-28a-hly), 经IPTG诱导后, SDS-PAGE分析可见一条56 kD的特异条带。Western blotting分析结果显示表达的Hly蛋白能与抗体发生特异性结合,说明其具有较好的免疫原性。将表达的溶血素蛋白制成类毒素疫苗免疫小鼠后, 具有较高的保护效力, 表明该类毒素疫苗有望作为预防由嗜水气单胞菌引起疾病的基因工程类毒素疫苗。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素(hemagglutinin,HA)蛋白是禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a(+)-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B(DE3)中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

西藏株小反刍兽疫病毒H蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

【背景】小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,严重威胁我国养羊业的发展。【目的】原核表达PPRVH蛋白,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GenBank中PPRV西藏株h基因序列,对其进行密码子大肠杆菌偏爱性优化,采用两步PCR法全化学合成全长h基因。将测序验证正确的h基因克隆至原核表达载体pET-28a、pET-30a、pET-32a,转化E. coli BL21(DE3)并利用IPTG诱导H蛋白表达。以经SDS-PAGE割胶纯化的重组H蛋白免疫新西兰大白兔制备抗PPRV H蛋白多克隆抗体。【结果】重组E. coli [pET-28a(-30a,-32a)-H]表达的重组H蛋白相对分子质量分别约为70、68和86 kD;诱导7 h时PRRV H蛋白表达量最高,而且主要以包涵体形式表达;重组E.coli(pET-30a-H)表达的H蛋白经SDS-PAGE割胶纯化后免疫新西兰大白兔制备的多抗血清能与表达的重组H蛋白发生特异性反应;ELISA法检测抗体效价在1:6400-1:25600之间。【结论】原核表达了PPRVH蛋白,并制备了高效价的抗H蛋白多克隆抗体,为进一步研究PPRV H蛋白的功能及H蛋白的线性B细胞表位作图奠定了基础。     

鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1及其突变体的原核表达

目的:构建鼠肝炎冠状病毒(MHV)非结构蛋白1(NSP1)及其突变体(NSP1 mu)的原核重组表达质粒,在大肠杆菌中分别融合表达重组NSP1及NSP1 mu。方法:以现有质粒载体为模板,扩增编码NSP1及NSP1 mu的基因片段,并克隆至pMD18-T克隆载体;菌落PCR鉴定阳性克隆并测序分析;将阳性克隆的目的片段亚克隆至表达载体pET-28a,并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并加入IPTG诱导表达,SDS-PAGE和免疫印迹分析目的蛋白的表达。结果:PCR扩增得到表达NSP1及NSP1 mu的特异片段,并克隆到pMD18-T载体,测序结果正确无误;构建了NSP1和NSP1 mu的重组表达质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中分别融合表达了重组NSP1及NSP1 mu,表达的目的蛋白均能与His单克隆抗体特异结合;用Ni-NTA琼脂糖试剂盒纯化重组蛋白,获得可溶性的NSP1及NSP1 mu,相对分子质量分别为27×103和28×103。结论:在大肠杆菌中分别表达并纯化获得了大量可溶性重组NSP1及NSP1 mu。     

Preparation and characterization of polyclonal and monoclonal antibodies against human interleukin 1 alpha (IL 1 alpha)

Polyclonal and monoclonal anti-human IL 1 alpha antibodies (Ab) have been established. These Ab neutralized human recombinant IL 1 alpha (rIL 1 alpha) activity effectively, but did not interfere with human rIL 1 beta, murine rIL 1 alpha, or human rIL 2 activity. Fifty percent of rIL 1 alpha activity (25 U/ml, or 2.5 ng/ml) was neutralized by less than 0.06 microgram/ml of rabbit anti-IL 1 alpha Ab (R-38.3G) and by less than 0.13 microgram/ml of monoclonal Ab (clone 28(3B1], respectively. In other experiments, 10 micrograms/ml of rabbit anti-IL 1 alpha Ab could effectively neutralize 50% of 2000 U of rIL 1 alpha activity, and the same amount of monoclonal Ab neutralized 50% of 500 U/ml of rIL 1 alpha activity. Not only IL 1 alpha activity in the thymocyte costimulator assay, but also IL 1-dependent IL 2 production by a human leukemic cell line, HSB.2 subclone, were blocked by these polyclonal or monoclonal Ab. In addition, pI 4.9 IL 1 activity produced by the myelomonocytic cell line THP-1 and by the Epstein-Barr virus-transformed B cell lines, were neutralized by these Ab, suggesting that these cell lines also produce IL 1 alpha. The specificity of these polyclonal and monoclonal Ab was further confirmed by immunochemical method (Western blotting), in which anti-IL 1 alpha Ab reacted with rIL 1 alpha in a specific manner. Furthermore, an enzyme-linked immunosorbent assay system has been developed that can detect low levels of IL 1 alpha activity (less than 0.3 ng/ml or less than 3 U/ml), which is still less sensitive than thymocyte comitogenic assay and considerably less sensitive than the D10 assay. Finally, anti-IL 1 alpha Ab-conjugated affinity columns were prepared, by which IL 1 alpha activity, but not IL 1 beta activity, was specifically adsorbed and eluted effectively.     

猴B病毒被膜糖蛋白gC的原核表达及诊断价值评价

目的:原核表达猴B病毒糖蛋白gC胞外区片段,评价其在猴B病毒血清学检测中的特异性和敏感性,为猴B病毒检测奠定基础。方法:利用PCR方法扩增gC胞外区基因片段,同时合成该片段的优化密码子序列,将其插入表达载体pET-28b(+)形成重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达;纯化蛋白先以Western印迹进行验证,再以ELISA方法和标准阳性、阴性血清评价其诊断价值。结果:直接从病毒DNA模板上获得的基因片段未能表达,而优化后的基因片段表达水平较高,表达蛋白的相对分子质量约为48×103,为包涵体形式,占菌体总蛋白的30%左右;Western印迹显示,重组蛋白能与猴B病毒阳性血清和His单克隆抗体发生免疫反应;34份标准阳性血清和25份阴性血清的ELISA检测结果显示,重组蛋白的敏感性和特异性分别为94.1%(32/34)和100%(25/25)。结论:利用原核表达系统制备的gC胞外区重组蛋白,可作为猴B病毒血清学检测抗原,其特异性和敏感性都较好。     

重组EpoAB-NGF模拟肽的神经营养功能

目的:研究重组融合蛋白红细胞生成素AB肽-神经生长因子模拟肽(EpoAB-NGF9和EpoAB-NGF/12)的神经营养作用。方法:构建pET-42a-EpoAB-NGF9/12原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),以IPTG诱导表达,亲和层析纯化重组蛋白,显微镜观察PC12细胞诱导分化,流式细胞仪检测凋亡细胞。结果:大肠杆菌表达的重组融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12分子量约为30kDa,抗GST抗体免疫印迹反应呈阳性。融合蛋白可以诱导PC12细胞分化,促进轴突生长。R2L1细胞去血清培养,凋亡细胞占(31.7±0.60)%,去血清后加入融合蛋白GST-EpoAB-NGF9/12,细胞凋亡率分别为(25.2±3.52)%、(25.7±1.46)%,呈现一定程度的抑制细胞凋亡的活性。结论:重组EpoAB-NGF模拟肽融合蛋白具有与NGF类似的神经营养作用。     

Use of a dual-origin temperature-controlled amplifiable replicon for optimization of human interleukin-1 beta synthesis in Escherichia coli

A new dual-replicon recombinant plasmid, pPR53-tsr, has been constructed; it is a derivative of the expression vector pPR-TGATG-1 [Mashko et al., Gene 88 (1990) 121-126]. In contrast to its progenitor, pPR53-tsr is a low-copy-number (low-Cop) plasmid amplifiable in temperature-dependent fashion. In addition to both the replicon and the par locus from plasmid pSC101, providing segregational stability and a low Cop at 28 degrees C, the new plasmid contains a mutant ColE1 replicon whose RNAII is synthesized under the control of the pL promoter. The presence of a thermolabile repressor, cIts857, allows the thermo-inducible amplification of pPR53-tsr; the increased plasmid Cop is estimated at approx. 200 per genome 6 h after thermal induction at 42 degrees C. Thus, pPR53-tsr can be used as a donor of the thermo-inducible dual-replicon fragment for recombinant plasmids. Here, we employ such an approach for optimization of production of human interleukin-1 beta (hIL-1 beta) in Escherichia coli at a high level. The thermo-induced level of recombinant hIL-1 beta (re-hIL-1 beta) biosynthesis was around 9% of total cellular protein when the dual-replicon high-Cop vector was used. A method based on acidification of the water-soluble protein fraction to pH 4.0 has been developed that allows for the isolation of 80%-pure re-hIL-1 beta. The homogeneous material was obtained by two subsequent hydrophobic sorbent chromatographies. The protein yield ranged between 3-5 mg of re-hIL-1 beta/g of wet cells. The re-hIL-1 beta specific activity was about 2 x 10(8) units/mg, coinciding with that of the authentic hIL-1 beta.