一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

分子生物学技术在热泉地质微生物学研究中的应用

陆地热泉是一类典型的极端生命-环境互作的地质系统,是我们认识生命与环境协同演化的天然实验室。然而,受限于有限的研究手段,热泉中仍存在大量未解密的微生物"暗物质"。这种困境随着技术的革新得到了改善,尤其是近几年来基于组学、探针和同位素标记的多元化检测手段在嗜热微生物多样性的挖掘、新物种和新代谢途径的发现以及嗜热微生物对元素地球化学循环的调控和响应等方面取得了一系列令人瞩目的研究成果,使得热泉极端微生物和地质环境内在联系的研究也成为地质微生物学研究的热点。立足于前人研究成果,本文将简述常用于热泉地质微生物学研究的分子生物学手段的发展,重点总结其在挖掘热泉微生物多样性和热泉微生物的环境功能研究中的应用及进展,最后对未来研究方向提出展望。     

3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建

【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。     

西南地区乡土杨树遗传变异的SRAP分析

采用SRAP分子标记技术对西南地区11种乡土杨树共333份样本的遗传变异进行分析,7对引物组合共扩增出215条带,其中多态性条带158条,多态性条带百分率为73.49%,表明11种乡土杨树间存在广泛变异。AMOVA分析结果显示,种间遗传变异分量为10.84,占总变异的48.70%,遗传差异达极显著水平(P0.001)。种间的遗传相似系数变幅在0.8199~0.9607之间,平均遗传相似系数为0.8983。聚类结果表明,昌都杨和藏川杨之间的遗传差异最小,大叶杨和三脉青杨之间的遗传差异最大。本研究结果为西南地区乡土杨树基因资源的保护、开发和利用提供了一定的科学理论依据。     

405份CIMMYT引进小麦种质的遗传多样性分析

为了明确国际玉米改良中心(CIMMYT)引进普通小麦种质材料的遗传多样性特点,为其利用提供参考依据,本研究从均匀分布于小麦基因组的420对SSR引物中选择出条带清晰、多态性较好的62对引物对引自CIMMYT的405份普通小麦种质系进行遗传多样性检测。结果表明,62对SSR引物在405份CIMMYT材料中共检测到198个等位变异,每对引物检测到等位变异的数目为2~8个,平均每对SSR引物能够检测到3.19个等位变异。单个SSR引物的PIC值介于0.03~0.79之间,平均值0.48。405份CIMMYT材料A、B、D基因组之间多态性位点数和等位变异数相差不大,PIC平均值B基因组(0.53)A基因组(0.52)D基因组(0.39)。聚类分析结果显示,62对SSR引物能够将405份CIMMYT材料区分开来,在0.1285遗传距离处将供试材料分为24个类群,类型较为丰富,不同类群的材料在农艺性状和品质性状上存在差异。     

金线兰及近缘种植物遗传多样性ISSR分子标记分析

利用ISSR分子标记技术对我国不同地区收集的金线兰及其近缘种种质资源进行亲缘关系及遗传多样性分析。结果显示:9条ISSR引物在50份材料中共扩增条带156条,其中多态性条带155条,多态性比率达99.36%;UPGMA树状图分析显示,样本总体相似系数介于0.56~0.90之间,在相似系数0.65处可分4大类群,其中金线兰主要集中于A大类群。A大类群又可分为3个亚类5个小亚类,亚类中不同地区来源的金线兰种质没有明显的界限。去除部分地区来源不明材料,46份材料依不同地理来源分成8个种群,其中福建野生金线兰4个种群,二者Nei's基因多样性指数(H)分别为0.322和0.295,处兰科植物中等水平;种群遗传分化系数(Gst)分别为0.328和0.240,处兰科植物较低水平。AMOVA分析显示样本种群内变异指数87%,种群间变异指数13%,表明种群间可能存在基因交流。     

基于SSR和ISSR的鄱阳湖流域野生菰资源的遗传多样性分析

用SSR和ISSR标记对鄱阳湖流域30个野生菰居群的遗传多样性与遗传结构进行了分析。筛选出的19对SSR引物共扩增出多态性条带253条,平均多态性条带比率(PPB)为91.67%,Nei's基因多样性指数(He)和平均Shannon信息指数(I)分别为0.2712和0.4144,遗传相似性系数(GS)为0.5590~0.8368,遗传距离(GD)的变化范围为0.1632~0.4410;筛选出的14个ISSR标记引物共扩增出83条条带,平均多态性条带比率(PPB)为78.29%,Nei's基因多样性指数(He)和平均Shannon信息指数(I)分别为0.2386和0.4174,遗传相似性系数(GS)为0.5132~0.9342,遗传距离(GD)变化范围为0.0658~0.4868。根据SSR和ISSR基因型数据,采用UPGMA法分别在阈值为0.698和0.728时可将30个野生菰居群聚为3类。可能受人为、水流、动物活动、风等多种因素的影响,居群间的亲缘关系与地理分布无明显相关性。本研究表明,鄱阳湖流域野生菰居群间SSR和ISSR基因型的多样性丰富,居群间的这种遗传差异或变异,对该地区乃至更大范围内野生菰的遗传进化、基因资源的开发利用和种质资源的保护有着重要意义。     

新疆野生油菜胞质雄性不育系1193A对应恢复基因的SSR标记分析

以油菜细胞质雄性不育系1193A和恢复系1193R2为亲本构建F2分离群体,并运用BSA法构建了可育和不育基因池。利用1521对SSR引物进行了多态性分析,结果表明有36对引物在亲本和基因池间都表现多态性,用F2单株验证表明有11对引物与恢复基因连锁,离恢复基因较近的2个标记CB10316和Bn GMS171分布在恢复基因Rf的两侧,遗传距离分别为3.9 c M和5.7 c M,可作为恢复系标记辅助育种的候选标记。     

华北低丘山区栓皮栎生态系统氧同位素日变化及蒸散定量区分

利用稳定同位素技术对华北低丘山区栓皮栎生态系统氧同位素日变化及蒸散定量区分进行研究,为华北低丘山区森林生态系统水汽交换研究提供基础。试验采用离轴积分腔输出光谱技术(OA-ICOS)连续测定生态系统不同高度水汽浓度和δ18O值,同时采用真空提取和液态水同位素分析仪测定枝条和土壤的δ18O值。结果显示,4个晴天中大气水汽浓度日变化复杂,变化趋势差异大,而δ18O日变化均成高-低-高的"V"型变化,最小值出现在12:00—18:00。Keeling方程在10:00—12:00的相关系数R2均大于0.71,方程达到极显著水平,表明此时段蒸腾速率较高,满足植物蒸腾的同位素稳定态假设。利用Keeling方程估算的栓皮栎生态系统δET值有相似的低-高-低日变化,与大气的δv值变化趋势相反。同位素分割结果显示栓皮栎生态系统中蒸腾占蒸散比例日变化呈现低-高-低的趋势,10:00—14:00蒸腾占蒸散比例达到90%以上,尽管6:00—10:00和14:00—18:00的蒸腾占蒸散比例下降,但平均值仍高达69.38%,表明华北低丘山区栓皮栎生态系统的蒸散主要来源于植物蒸腾。     

菲律宾蛤仔EST_SSR标记与生长性状的相关分析

研究利用20个微卫星标记对菲律宾蛤仔斑马蛤F2代家系107个个体进行遗传多样性分析,并对标记位点与生长相关性状进行分析。在20个微卫星位点共检测到41个等位基因,各位点等位基因数为2—3个,等位基因片段大小为109—430 bp,平均等位基因数为2.05个。平均有效等位基因数为1.71个,观测杂合度平均值为0.504,期望杂合度的平均值为0.431,平均多态信息含量为0.324。经卡方检验,3个位点SSR11,SSR164和SSR213的基因型分布显著偏离了孟德尔定律(P0.01)。运用SPSS 20.0对20个微卫星位点与菲律宾蛤仔斑马蛤家系生长性状的相关性(壳长、壳宽、壳高和体重)进行连锁显著性检验。结果表明,SSR9位点与壳高存在显著的相关关系(P0.05),SSR135和SSR164位点与壳宽呈显著相关(P0.05),SSR142位点与体重呈显著性相关(P0.05)。研究结果可为菲律宾蛤仔的分子标记辅助选育提供参考。