生防放线菌Ahn75的荧光标记及其在水稻中的定殖

【背景】目前gfp标记基因已成为研究靶标微生物与宿主之间互作的一种重要工具。利用gfp基因标记生防菌株,可以对生防菌株的生存及定殖能力进行有效追踪。【目的】对生防放线菌Ahn75进行荧光标记,探讨其在水稻中的定殖规律,为研究Ahn75的稻瘟病防治机制奠定基础。【方法】首先通过电激转化将含绿色荧光标记基因(gfp)的质粒pIJ8655导入大肠杆菌ET12567中,然后采用接合转移的方法将gfp整合到Ahn75基因组上;通过平板对峙试验检验Ahn75-GFP在标记绿色荧光后对稻瘟病病原菌的抑菌活性;采用喷施孢子液的方式将带荧光标记的Ahn75-GFP定殖水稻,并利用荧光显微镜观察生防菌在水稻中的定殖情况;对定殖水稻中的内生菌进行重分离,探究菌株在水稻组织中的分布规律。【结果】PCR扩增和荧光观察表明,绿色荧光标记基因成功整合到生防放线菌Ahn75中。通过平板对峙试验,发现Ahn75-GFP对稻瘟病病原菌抑菌活性与原始菌株没有显著差别。在荧光显微镜下,可以观察到Ahn75-GFP能稳定定殖于水稻的根、茎、叶等组织中,而水稻内生菌重分离试验表明该菌株在茎中的定殖力最强。【结论】获得一株绿色荧光标记生防菌株Ahn75-GFP,结果显示该菌株定殖水稻效果良好,这对于研究Ahn75的稻瘟病防治具有重要意义。     

一种强力霉素诱导型白念珠菌基因敲除与筛选标记再循环工具包

【目的】在白念珠菌中建立一个快捷方便经济的基因敲除与筛选标记再循环的DNA操作系统。【方法】通过ExoIII介导的不依赖于连接酶的克隆策略,在异源筛选标记基因CmLEU2、CdHIS1和CdARG4基因的两侧分别插入了loxP位点,成为筛选标记基因盒扩增的模板。全基因合成了经过白念珠菌密码子优化的rTetR元件,并组装成Tet-on启动子。将密码子优化的重组酶Cre基因置于该启动子控制下。然后将他们插入筛选标记基因CdHIS1和CdARG4的CDS区域,形成筛选标记基因再循环载体。【结果】构建了3个用于白念珠菌基因敲除的侧翼含有loxP位点的筛选标记基因载体,以及2个含有Tet-on启动子控制的Cre酶的载体用于筛选标记基因的再循环。【结论】成功构建了一个白念珠菌中可诱导的基因敲除和筛选标记再循环的载体系统并成功应用于多个基因缺失株构建。这个系统有助于快速构建白念珠菌的单基因和多基因敲除菌株。     

分子生物学技术在热泉地质微生物学研究中的应用

陆地热泉是一类典型的极端生命-环境互作的地质系统,是我们认识生命与环境协同演化的天然实验室。然而,受限于有限的研究手段,热泉中仍存在大量未解密的微生物"暗物质"。这种困境随着技术的革新得到了改善,尤其是近几年来基于组学、探针和同位素标记的多元化检测手段在嗜热微生物多样性的挖掘、新物种和新代谢途径的发现以及嗜热微生物对元素地球化学循环的调控和响应等方面取得了一系列令人瞩目的研究成果,使得热泉极端微生物和地质环境内在联系的研究也成为地质微生物学研究的热点。立足于前人研究成果,本文将简述常用于热泉地质微生物学研究的分子生物学手段的发展,重点总结其在挖掘热泉微生物多样性和热泉微生物的环境功能研究中的应用及进展,最后对未来研究方向提出展望。     

3A蛋白104–115位氨基酸缺失口蹄疫A型标记病毒的构建

【目的】构建一株含3A非结构蛋白104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,分析其生物学特性和发展标记疫苗的潜力。【方法】采用融合PCR技术,在当前流行毒株A/Sea-97/CHA/2014全长感染性克隆p QAHN中引入3A104–115位氨基酸的缺失,构建全长重组质粒。全长质粒经NotI线化后转染表达T7RNA聚合酶的稳定细胞系,拯救标记病毒。RT-PCR、序列分析、间接免疫荧光和Western blotting鉴定标记病毒。噬斑表型和一步生长曲线分析标记病毒的生物学特性,并用实验室开发的针对3A优势表位(AEKNPLE)的阻断ELISA方法分析其区分亲本和标记病毒感染的动物。【结果】成功拯救到一株含3A 104–115位氨基酸缺失的口蹄疫A型标记病毒,3A表位的缺失没有影响标记病毒的噬斑表型和一步生长曲线。3A单抗阻断ELISA可以明显区分标记病毒和亲本病毒感染的动物。【结论】本研究构建的3A蛋白104–115位氨基酸缺失的标记病毒可以作为发展口蹄疫鉴别诊断疫苗的候选毒株,用于我国未来口蹄疫A型的有效防控。     

花生分子标记的研究进展

国内外对花生的研究特别是在分子水平上的研究相对水稻、油菜等农作物比较薄弱。近些年,分子标记技术迅速发展,在花生上也得到广泛的应用。本文从花生属起源、种质资源的遗传多样性、抗性基因的标记和指纹图谱等方面,综述了国内外花生分子标记的研究进展。     

用形态与分子标记研究石刁柏种质资源遗传多样性

采用RAPD分子标记结合形态学指标对43份石刁柏种质资源的遗传多样性进行评价。田间试验相关分析表明,茎粗、林高、茎数与产量呈极显著正相关,三者是影响石刁柏产量的主要因素。茎粗、株高、产量与一级笋率呈显著正相关。花梗全紫的石刁柏一级笋率相对较高。根据形态学指标将材料分为7大类。在分子标记中,从60个随机引物中筛选出12个能产生清晰、稳定可重复DNA片段的引物,对供试材料进行RAPD扩增。在供试材料中共获得183条扩增产物,产生的DNA片段大小主要分布在200～1600bp之间,其中170条具有遗传多态性,约占总数的92．92％。各基因型间的Nei氏相似性系数分布在0．407～0．931之间,平均相似性为0．765,可见石刁柏各基因型之间的遗传多态性较为丰富。经UPGMA方法建立的树状图,可将参试品种划分为8大类群。形态学指标与遗传多样性指标的相关分析结果显示：分枝节间距、花梗颜色、每簇拟叶数、最长分枝长度、茎粗5个形态学指标与遗传多样性指标之间存在一定的相关性。     

Molecular Tagging and Mapping of Quantitative Trait Loci for Lint Percentage and Morphological Marker Genes in Upland Cotton

Using 219 F2 Individuals developed by crossing the genetic standard line TM-1 and the multiple dominant marker line T586 In Gossyplum hirsutum L., a genetic linkage map with 19 linkage groups was constructed based on simple sequence repeat （SSR） markers. Compared with our tetraploid backboned molecular genetic map from a （TM-1xHal 7124）xTM-1 BC1 population, 17 of the 19 I｜nkage groups were combined and anchored to 12 chromosomes （sub-genomes）. Of these groups, four morphological marker genes In T586 had been mapped Into the molecular linkage map. Meanwhile, three quantitative trait loci for lint percentage were tagged and mapped separately on the A03 linkage group and chromosome 6.     

稳定性同位素探测技术在微生物生态学研究中的应用

稳定性同位素标记技术同分子生物学技术相结合而发展起来的稳定性同位素探测技术（stableisotope probing,SIP）,在对各种环境中微生物群落组成进行遗传分类学鉴定的同时,可确定其在环境过程中的功能,提供复杂群落中微生物相互作用及其代谢功能的大量信息,具有广阔的应用前景.其基本原理是：将原位或微宇宙（microcosm）的环境样品暴露于稳定性同位素富集的基质中,这些样品中存在的某些微生物能够以基质中的稳定（性同位素为碳源或氮源进行物质代谢并满足其自身生长需要,基质中的稳定性同位素被吸收同化进入微生物体内,参与各类物质如核酸（DNA和RNA）及磷脂脂肪酸（PLFA）等的生物合成,通过提取、分离、纯化、分析这些微生物体内稳定性同位素标记的生物标志物,从而将微生物的组成与其功能联系起来.在介绍稳定性同位素培养基质的选择及标记方法、合适的生物标志物的选择及提取分离方法的基础上,举例阐述了此项技术在甲基营养菌、有机污染物降解菌、根际微生物生态、互营微生物、宏基因组学等方面的应用.     

无选择标记和载体骨干序列的Xa21转基因水稻的获得

利用双右边界T-DNA载体通过根癌农杆菌介导法将水稻白叶枯病广谱抗性基因Xa21导入杂交稻重要恢复系C418中。T0代共获得27个独立转基因株系,通过田间抗性鉴定与PCR分析,有17个株系的Xa21基因分子鉴定为阳性,且对白叶枯病原菌P6生理小种具有抗性。通过对17个株系的后代植株进行田间抗性鉴定,分子标记辅助选择及Southern杂交分析,结果显示4个株系的T1代植株中能分离出无潮霉素标记基因的Xa21转基因植株。无选择标记Xa21转基因株系的获得率为15%。PCR检测还表明,这些无选择标记的Xa21转基因植株不带有载体骨架序列。通过对转基因后代进一步的抗性鉴定与PCR辅助选择,获得了无选择标记和载体骨架序列的转基因Xa21纯合的抗白叶枯病水稻。     

棕榈ISSR反应条件的筛选与优化

应用ISSR技术对棕榈(Trachycarpusfortunei)进行分析研究,对影响ISSR反应的各因子进行探讨,确定了该研究的最佳反应条件,建立了棕榈ISSR反应的最佳反应体系,为进行棕榈居群遗传多样性的研究奠定了基础。