抗呼吸道合胞病毒融合蛋白单链抗体的筛选及初步鉴定

目的：从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗呼吸道合胞病毒F蛋白的单链抗体。方法：以RSV F蛋白为靶抗原,通过“吸附-洗涤-洗脱-扩增”过程从天然人源性噬菌体抗体库中筛选特异性抗F蛋白单链抗体。5轮筛选后,单克隆经ELISA检测,阳性克隆进行核酸序列分析,并将阳性克隆噬菌体感染E.coli HB2151,经IPTG诱导,制备抗RSV F蛋白的可溶性单链抗体,并进行Western及Dot blot分析。结果：经过筛选,获得了18株能与F蛋白特异性结合的阳性克隆,取OD值最高的克隆E4经测序并检索Kabat数据库分析,显示其基因与人免疫球蛋白可变区基因具有高度同源性,Western及Dot blot分析表明为单链抗体。结论：利用天然人源性噬菌体抗体库技术制备出高特异性的人源性抗RSV F蛋白单链抗体。     

通心络治疗与SAMP8早期脑内淀粉样病变改善的相关性研究

目的:研究中药通心络(TXL)与治疗SAMP8小鼠早期脑内淀粉样病理变化改善的相关性.方法:取4月龄雄性SAMP8小鼠,随机分为6组:SAMP8(空白对照)组、石杉碱甲(阳性对照)组、TXL低剂(治疗)组、TXL中剂(治疗)组、TXL高剂(治疗)组、SAMR1(对照)组,每组15只.于第八周末,检测海马神经元染色质聚缩情况、皮质和海马耱原沉积情况、脑内淀粉样物质沉积情况、小鼠皮质Aβ 1-42寡聚体的水平.结果:(1)HE染色结果显示SAMP8组有明显的核深染现象,通心络治疗组有改善;(2)与SAMP8对照组相比,TXL中剂组、TXL高剂组淀粉样沉积均有显著性差异(P＜0.01);(3)与SAMP8组相比,TXL低剂组(P＜0.05)、TXL中剂组(P＜0.01)和TXL高剂组(P＜0.05)PAS阳性颗粒(acid-Schiff(PAS)-positive granular structures,PGS)显著减少;(4)与SAMP8相比,TXL各治疗组Aβ 42寡聚体水平均有显著性降(P＜0.01);(5)TXL治疗剂量与淀粉样沉积、糖原沉积具有相关性,TXL中剂量治疗即可达到改善的效果,而Aβ 42寡聚体聚集水平与TXL剂量有显著的线性负相关(r=-0.856,P＜0.01).结论:通心络治疗能够明显改善SAMP8小鼠早期脑内淀粉样病变.     

单引物PCR法引入定点突变 *

目的:利用单个突变引物,在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pcDNA3.1(+)-F质粒中,通过单次环形PCR在特定序列位置引入定点突变。 方法: 以双链环状的pcDNA3.1(+)-F质粒DNA为模板,设计分别含有三种目的突变N70Q, I431N, Q270T的三条单引物,分别进行单次PCR。用甲基化DNA特异的限制性内切酶Dpn I处理PCR产物后转化大肠杆菌DH5α,进行克隆筛选,酶切鉴定和测序分析。 结果: 酶切鉴定结果和测序结果均符合预期,利用单引物PCR法成功在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pcDNA3.1(+)-F质粒DNA 中引入了单碱基突变、两个间隔碱基突变及相邻三碱基突变三种目的突变。 结论: 单引物PCR法解决了常规定点突变方法中多个PCR反应,程序繁琐及突变效率低等问题,是一种简便、快速、有效的基因工程定点突变新方法。     

人呼吸道合胞病毒微型复制子的构建

摘要：【目的】构建RSV微型复制子（minireplicon）并进行功能学研究。【方法】构建含RSV病毒前导序列（Leader, genomic promoter, Le）、转录起始信号（gene start, GS）、多克隆酶切位点、转录终止信号（gene end, GE）和尾随序列(Trailer, antigenomic promoter, Tr)的基因片段GSGE,通过引入T7 RNA多聚酶（T7 RNA polymerase, T7 RNP）启动子、克隆入载体px8δT和插入增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）等多步操作,获得RSV微型复制子重组质粒px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP。同时构建可表达大蛋白（large protein,L）的质粒pcDNA3.1/L及表达转录延长/转录终止抑制因子（M2 ORF 1 protein,M2-1）的质粒pcDNA3.1/M2-1。通过脂质体法共转染RSV微型复制子质粒及四种RSV核壳体蛋白质粒至可表达T7 RNP的BSRT7/5细胞系,倒置荧光显微镜及流式细胞仪分析EGFP的表达情况。【结果】成功构建了px8δT/GSGE1/EGFP和px8δT/GSGE2/EGFP及pcDNA3.1/L和pcDNA3.1/M2-1,五质粒共转染BSRT7/5细胞,倒置荧光显微镜及流式细胞仪均观察到绿色荧光的表达。【结论】构建的RSV微型复制子具有转录和复制功能,将有助于进一步开展以RSV反向遗传操作为基础的RSV疫苗研究。     

自噬稳态调控与阿尔茨海默病防治策略

自噬是真核细胞中降解易聚集蛋白质的重要途径,以应激和损伤时更为显著。自噬与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)密切相关,在AD中起到"双刃剑"的作用,与致病性β淀粉样肽(Aβ)和细胞骨架相关tau蛋白的生成和代谢都有密切的关系。随着对自噬机制的深入了解,人们发现了自噬在AD病理过程中的调节作用。综述了自噬的基本机制、自噬与AD发病的互作关系以及如何从自噬的信号转导途径入手,调整AD自噬稳态及重平衡,从而探索新的AD治疗性药物靶标。     

呼吸道合胞病毒载体疫苗研究进展

人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus, RSV)是引起婴幼儿下呼吸道感染的最重要的病毒病原,RSV载体疫苗可在人细胞内从头合成,形成的蛋白质构象与RSV自然感染后表达的完全相同,不会导致抗原表位的丧失或变化,形成的免疫力更利于抵抗随后的自然感染;经黏膜途径免疫不会产生疾病增强作用,且能突破母传抗体的干扰,因而受到广泛关注。对近年来RSV载体疫苗的研究进展进行了综述。     

用重组腺病毒表达A组轮状病毒主要中和抗原VP7可获得良好的免疫学效果

为探索利用重组腺病毒表达轮状病毒的结构抗原以制备轮状病毒基因工程疫苗的可行性,构建了一株可表达A组轮状病毒主要中和抗原VP7的重组腺病毒AdEasyCVP7.AdEasyCVP7感染293细胞后,RT－PCR证明VP7基因有转,Western blotting试验可检测到VP7的表达。随后,用AdEasyCVP7通过灌胃和滴鼻两种不同途径免疫小鼠,并对免疫后小鼠的血清抗体和粘膜抗体进行了比较。初次免疫后,两组小鼠均有应答,但血清抗体滴度及阳转率不同。再次免疫后,滴鼻组小鼠显示出明显的加强效果。对肺灌洗液中的sIgA及肺、肠粘膜组织匀浆中的IgA进行检测发现滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对血清中和抗体的检测表明,初次和再次免疫后,两组小鼠血清中均有中和抗体产生。该研究为轮状病毒基因工程疫苗的免疫方案、免疫途径及免疫保护作用等的进一步研究奠定了基础。     

人源性天然抗体库的构建及淀粉样蛋白Ab1-42寡聚体单链抗体的筛选和鉴定

本研究旨在利用噬菌体展示技术构建人源性天然抗体库,以可溶性Aβ1-42寡聚体对抗体库进行筛选获得针对低分子量Aβ1-42寡聚体的特异性单链抗体。利用RT-PCR法从10个健康人外周血淋巴细胞中得到全套人抗体VH和VL基因,经过重叠延伸PCR将VH和VL连接得到scFv片段,将scFv片段酶切后克隆至pCANTAB5E噬菌体载体,电转化TG1感受态菌,获得库容为2.5×109单链抗体库。经辅助噬菌体M13K07拯救,以可溶性Aβ1-42寡聚体为抗原,对抗体库进行4轮筛选,ELISA法筛选特异性识别Aβ1-42寡聚体的阳性克隆,将筛选到的阳性克隆B19转化至E.coli HB2151菌,诱导表达可溶性scFv抗体。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示可溶性scFv抗体获得了正确表达,且能够与Aβ1-42三聚体及纤维特异性结合,亲和力(Kd)为9×10-6 mol/L。Aβ1-42寡聚体特异性单链抗体的获得为老年性痴呆(AD)的治疗研究奠定了基础。     

人呼吸道合胞病毒感染的A549细胞中长链非编码RNA表达谱研究

目的:探讨人呼吸道合胞体病毒(human respiratory syncytial virus,RSV)感染A549细胞的长链非编码RNA(long non-coding RNAs,lncRNA)表达谱的差异,更好地了解宿主与RSV之间的相互作用的可能分子机制。方法:1 MOI RSV感染A549细胞,24h后提取RNA,利用Agilent的lncRNA表达谱芯片,筛查了RSV感染和未感染的A549细胞中的lncRNA差异表达谱,并进行实时定量PCR验证,通过GO和KEGG对差异mRNA和lncRNA进行生物信息学分析。结果:RSV感染的A549细胞与未感染的A549细胞相比,共有1463个lncRNA和1552个mRNAs显著上调,有944个lncRNA和1489个mRNAs下调,差异表达lncRNA及其预测靶基因主要富集于免疫应答过程。通过定量PCR证实所选lncRNA的表达谱结果。结论:RSV感染A549细胞后,lncRNA表达谱发生明显变化,对深入研究lncRNA如何参与RSV与宿主之间的相互作用奠定了基础。     

腺病毒载体纤突结的改造及改造后的特性研究

目的:采用一种简便方法在复制缺陷型腺病毒载体纤突结(fibre knob)的HI loop插入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycine-aspartate,RGD)肽,构建纤突结修饰的腺病毒载体,观察其对RD和T24肿瘤细胞的感染效率以及机体针对外源基因的抗体反应.方法:以PCR方法将RGD插入到pA...