DNA聚合酶对PacBio SMRT测序结果影响的评价

目的评估不同DNA聚合酶是否会对以16SrRNA全长为测序靶点的肠道微生物多样性研究结果产生影响。方法用美国太平洋公司的三代测序仪(PacBio single molecule real-time sequencing technology)对3份分别采用KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶扩增的军犬粪便样品进行精确至"种"水平的测序分析。结果经配对Mann-Whitney U检验显示,不同DNA聚合酶扩增的同一样品在门、属和种水平上差异无统计学意义(P>0.05),然而在某些相对含量较少的操作分类单元(OTU)上,其扩增效率存在差异。经基于非加权UniFrac距离的非加权组平均法聚类分析和基于加权UniFrac距离的非参数多元方差分析发现不同DNA聚合酶扩增的同一样品其多样性差异无统计学意义(P>0.05)。结论 KAPA HiFi^TM HotStart DNA聚合酶和PCRBIO HotStart DNA聚合酶虽对模板DNA扩增存在一定的偏好性,但该偏好性不影响PacBio SMRT测序结果。     

加勒比松种源苗期DNA甲基化多样性分析

为了解加勒比松(Pinus caribaea)种源的遗传多样性,利用甲基化敏感扩增多态性技术对加勒比松3个变种17个种源的DNA甲基化多样性进行了研究。结果表明,56对引物组合共扩增出425条谱带,其中多态性谱带422条,多态性百分率为99.25%。加勒比松种源幼苗半甲基化比率比全甲基化比率稍高,洪都拉斯加勒比松、古巴加勒比松和巴哈马加勒比松的DNA甲基化率分别为22.39%、22.29%和22.35%,差异不显著。加勒比松的DNA序列遗传多样性(H=0.4376)高于DNA甲基化多样性(H=0.3274),Mantel检验表明,基因组遗传变异与表观遗传变异不存在相关性(r=-0.171,P=0.16)。表观聚类与遗传聚类间存在较大差异,两种聚类分析结果均未将3个加勒比松变种分开。这表明加勒比松变种间的表观遗传变异极为丰富,能为加勒比松遗传改良提供优良种质资源。     

DNA条形码技术及其在微生物资源鉴别保护中的应用研究

DNA条形码作为一种新型的物种鉴定、分类、鉴别和溯源方法,通过生物信息学分析将标准DNA片段进行分析比对实现。经过多年的发展,该技术现已成为物种鉴定和分类的研究热点。回顾十余年来DNA条形码技术的发展历程,介绍了这一技术的进展与成果,分析了该技术的优势及局限,并展望了DNA条形码的应用前景,为后续研究提供参考。     

基于单波长激发的定量FRET成像

本文发展了一种针对于固定FRET质粒的单波长激发的E-FRET方法(SDW-E-FRET)。相比于EFRET方法,SDW-E-FRET只需要测量供体激发时供体通道的荧光强度(IDD)和FRET通道的荧光强度(IDA),因此该方法可以实现活细胞的快速定量FRET成像。结合双通道荧光显微成像系统,该方法无需任何机械切换,定量FRET成像的速度只取决于CCD相机的成像速度,因而特别适合活细胞实时动态定量FRET成像。在本研究小组发展的双通道荧光显微镜平台上,应用SDW-E-FRET方法测量了C5V和C17V的FRET效率,得到了与其它方法测量的一致的结果。     

基于间隔二肽组分和递归特征消除法的DNA结合蛋白的鉴定

DNA结合蛋白(DNA-binding proteins,DBPs)的鉴定在原核和真核生物的基因和蛋白质功能注释研究中具有十分重要的意义.本研究首次运用间隔二肽组分(gapped-dipeptide composition,Gap DPC)结合递归特征消除法(recursive feature elimination,RFE)鉴定DBPs.首先获得待测蛋白质氨基酸序列的位置特异性得分矩阵(position specific scoring matrix,PSSM),在此基础上提取蛋白质的Gap DPC特征,通过RFE法选择最优特征,然后利用支持向量机(support vector machine,SVM)作为分类器,在蛋白质序列数据集PDB396和LB1068中进行夹克刀交叉验证(jackknife cross validation test).研究结果显示,基于PDB396和LB1068数据集,DBPs预测的准确率、Matthews相关系数、敏感性和特异性分别达到93.43%、0.86、89.04%和96.00%,以及86.33%、0.73、86.49%和86.18%,明显优于文献报道中的相关方法,为DBPs的鉴定提供了新的模型.     

机械伤害处理橡胶树萌条树皮的DNA甲基化分析

该研究采用甲基化敏感扩增多态性技术,分析了机械伤害处理橡胶树萌条树皮的DNA甲基化的变化。结果显示：（1）与对照相比,伤害后0.5和2 h,DNA甲基化水平略有上升;伤害后48 h的DNA甲基化水平出现了较大幅度的下降。（2）甲基化变化类型分析表明,在伤害2 h主要发生了DNA的甲基化;伤害后48 h,主要发生了DNA的去甲基化。（3）差异甲基化位点的回收、测序及注释表明,ATP合酶F1亚基1、磷酸核糖胺 甘氨酸类连接酶、冷激结构域蛋白3、光系统II 47 kD 蛋白、E3泛素蛋白连接酶RING1、NADH泛醌氧化还原酶和一些假定蛋白参与了伤害的响应。（4）经重亚硫酸盐测序验证,ATP合酶F1亚基1和NADH泛醌氧化还原酶的CCGG位点发生了去甲基化。研究推断DNA的甲基化可能参与了橡胶树萌条对机械伤害的响应。     

应用液滴数字PCR技术检测rs6983267三种多态性位点

核苷酸的多态性检测在临床以及基础生命科学研究中占据着重要地位.目前基于PCR的探针法应用最为广泛.由于在核苷酸上微小差异,探针的设计往往带有交叉活性反应,这阻碍了qPCR方法的推广.数字PCR(dPCR)是近年来已成功实现商业化的基于单分子分析的核酸检测技术.通过对条件的优化,dPCR可以消除探针的交叉活性,不过目前商业化的dPCR一般只有2个通道,对于同时检测3个多态性需要更加细致的优化.本研究以rs6983267位点的CCAT2基因3种多态性检测为例,利用探针的交叉活性反应检测其3个多态性位点.检测涉及到3个探针:2个针对多态性位点,另1个位于多态性位点外侧作为参照探针.结果表明,成功地区分了3个包含多态性位点基因片段的簇.在本研究中交叉活性反应可以为dPCR留出白空间,利于多样品的检测.     

慈竹叶蝉类害虫DNA条形码分析

叶蝉类昆虫形态结构多样,在农林生态系统的物种多样性和植物保护工作中扮演着重要角色,但其物种的准确鉴定一直是农林植保工作中的难点。DNA条形码技术极大促进了农林生态系统物种的快速、准确鉴定。本研究经过连续2年的野外调查采集慈竹Bambusa emeiensis主要叶蝉种类,扩增了广泛分布于中国慈竹的12种主要叶蝉类害虫的线粒体基因COⅠ和16S rRNA序列片段,并进行了遗传距离、系统发育及矢量Klee-diagram图分析。结果显示:慈竹叶蝉昆虫COⅠ基因序列片段(590 bp)种内遗传距离为0.004,种间遗传距离为0.283;16S rRNA基因序列片段(463 bp)种内遗传距离为0.003,种间遗传距离为0.257;不同种间存在明显的条形码间隔。2个基因序列片段的分子系统发育分析结果与形态学研究谱系关系一致。Klee-diagram图分析结果和分子系统发育结果一致。上述结果表明,COⅠ和16S rRNA基因适用于慈竹叶蝉类昆虫的物种鉴定,可为竹林叶蝉类昆虫的准确快速鉴定提供参考方法。     

葡萄品种DNA指纹数据库的构建及遗传多样性分析

利用SSR分子标记技术对314份葡萄品种进行了DNA指纹数据库构建和遗传多样性分析,为葡萄品种鉴定、亲缘关系分析和植物品种权保护提供科学依据。结果表明:9对引物共扩增出199个等位基因,多态性位点为199个,多态性比率达100%,每个标记检测到的位点数在17~31之间,平均为22.1个;多态性信息含量(PIC)值变幅在0.793~0.886之间,平均值为0.839。本研究发现3组同名异物品种和9组疑似同物异名品种,除此之外的290份品种中,70份品种仅需1对引物即可区分开,其余品种需要引物组合来实现品种之间的区分。最少选用8对引物即可完全区分开290份葡萄品种。最终利用8对多态性SSR引物构建了314份供试材料的DNA指纹数据库,聚类分析结果表明:263份二倍体供试材料可被分为真葡萄亚属和圆叶葡萄亚属两大类,而真葡萄亚属又被分为15个亚类。51份多倍体供试材料被分为3组,聚类结果与供试材料已知的系谱来源基本吻合。     

地高辛标记Ucp2基因RNA探针的制备和应用

目的:制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法:提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。