应用液滴数字PCR技术检测rs6983267三种多态性位点

核苷酸的多态性检测在临床以及基础生命科学研究中占据着重要地位.目前基于PCR的探针法应用最为广泛.由于在核苷酸上微小差异,探针的设计往往带有交叉活性反应,这阻碍了qPCR方法的推广.数字PCR(dPCR)是近年来已成功实现商业化的基于单分子分析的核酸检测技术.通过对条件的优化,dPCR可以消除探针的交叉活性,不过目前商业化的dPCR一般只有2个通道,对于同时检测3个多态性需要更加细致的优化.本研究以rs6983267位点的CCAT2基因3种多态性检测为例,利用探针的交叉活性反应检测其3个多态性位点.检测涉及到3个探针:2个针对多态性位点,另1个位于多态性位点外侧作为参照探针.结果表明,成功地区分了3个包含多态性位点基因片段的簇.在本研究中交叉活性反应可以为dPCR留出白空间,利于多样品的检测.     

改进重叠延伸法引入DNA定点突变的新方法

目的：改进重叠延伸PCR法,实现一种引入DNA定点突变的准确简便方法。方法：通过应用不同的扩增酶和反应体系,以重叠延伸PCR的方法产生引入突变位点的DNA片断,然后再亚克隆到载体中。该文以人cyclin D1启动子的NF-κB位点（-39/-30）为例。结果：通过DNA测序证明定点突变成功引入。一次引入4个突变碱基。突变引入率为100%。     

RNAi沉默Snail增加结肠癌对5氟尿嘧啶敏感性研究

目的:研究Snail的抑制是否能增加耐药结肠癌细胞对5-FU的敏感性,评估其可能的信号转导通路。方法:使用5-氟尿嘧啶耐药HCT116细胞(HCT116/5-FU),评估细胞形态及分子的变化。通过靶向人Snail基因小干扰RNA(si RNA)抑制Snail的表达。Annexin V/PI染色用于评估5-FU诱导的细胞凋亡。Western blot检测caspase以及可能的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和线粒体途径。结果:HCT116细胞对5-Fu耐药性的获得诱导了与EMT一致的形态学变化。RNA干扰沉默Snail逆转HCT116/5-FU细胞EMT并增加了5-FU耐药HCT116细胞对5-FU的敏感性。可能的机制涉及JNK与线粒体途径的激活。结论:EMT样表型的改变与HCT116细胞对5-FU耐药相关;si RNA介导的Snail下调可能是一个潜在的克服5-FU化疗耐药的治疗方法。     

SiO2NPs通过诱导氧化应激激活Fas/FasL通路促进TM4细胞凋亡

目的 探讨纳米二氧化硅（silicon dioxide nanoparticles,SiO₂NPs）对小鼠睾丸支持细胞（TM4）的毒性作用及其分子机制。方法 将TM4细胞暴露于不同浓度的SiO₂NPs（0、1、10、100 mg/L）培养液24 h,处理结束后,采用光学显微镜和CCK-8法检测小鼠睾丸支持细胞的形态和活性。利用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧（ROS）水平,MDA和SOD试剂盒检测细胞内的丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性。利用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒分析TM4细胞的凋亡水平,免疫印迹法检测Fas、FasL、Caspase-8、Caspase-3、Bax和Bcl-2等细胞凋亡信号分子的蛋白质表达水平。结果 研究发现,SiO₂NPs呈剂量依赖性地抑制TM4细胞增殖,降低细胞存活率和数量,并影响细胞的形态结构。此外,SiO₂NPs诱导TM4细胞产生过量ROS,引起脂质过氧化产物MDA含量以及抗氧化酶SOD活性增加导致氧化应激。进一步研究显示,SiO₂NPs显著增加TM4细胞凋亡水平,并激活Fas/FasL死亡受体介导的细胞凋亡信号通路。有意思的是,抗氧化剂NAC可以通过降低氧化应激水平有效缓解SiO₂NPs引起的TM4细胞损伤和细胞凋亡。结论 综上,SiO₂NPs通过诱导氧化应激激活Fas/FasL信号通路促进TM4细胞凋亡。     

位点特异DNA甲基化调控细胞周期素D1基因

DNA甲基化是基因表达调控的重要方式，一般被认为以CpG岛形式发挥作用；近年的研究表明，位点特异的DNA甲基化以元件(cis-regulatory element)的形式在生物微进化以及基因精细调控中发挥重要作用。我们的研究结果显示，曲古抑菌素A (trichostatin A,TSA)导致细胞周期蛋白D1基因表达下调，以及其核心启动子的+65到+77之间的两段串联CpG序列发生DNA甲基化。报告基因结果显示，由细胞周期素D1核心启动子片段驱动的报告基因活性在TSA处理后下降到原来0.12,而前段(A)突变与后段(B)突变时，报告基因活性分别下降到原来1/7.6与1/8.36,双突变则下降到原来1/7.51。对于CMV启动子嵌合15 bp片段驱动的报告基因活性，野生型、A、B与AB双突变型报告基因活性分别下降1/1.48、1/1.17、1/1.51以及1/1.21。体外甲基化研究结果显示，与对照组相比，M.SssⅠ处理组的启动子活性中，野生型活性下降到原来1/8 800,A突变型活性下降到原来1/2 700,B突变型活性下降到原来1/4 156,双突变型活性下降到原来1/6 222。应...