基因治疗研究进展

基因治疗研究进展陈诗书（上海第二医科大学,上海２０００２５）关键词基因治疗载体造血细胞标记恶性肿瘤ＡＩＤＳ心血管疾病１９９６年９月２５～２９日在美国冷泉港实验室举行了基因治疗会议,交流的论文摘要有３８８篇,覆盖了当前基因治疗研究的各个方面的最新进展,...     

新型表达载体 pEC34 试用于人 γ 干扰素基因的高表达

构建了一个新的双顺反子表达载体ｐＥＣ３４,它的第一个顺反子是已高表达的ｅｒａ基因的部分序列,并带有原核翻译增强子。当检测ｐＥＣ３４的可用性时,获得了人γ－干扰素的极高表达。目的蛋白占菌体总蛋白的８５．５％,诱导后经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,出现分子量为１５．５ｋＤａ左右的蛋白表达带。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ结果证实为人γ－干扰素。无压力传代３０次表达质粒仍然稳定,表明ｐＥＣ３４可能用作真核蛋白质高表达     

在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的策略

基因打靶技术是一种通过同源重组按预期方式改变生物活体的遗传信息的实验手段,与小鼠胚胎干细胞培养系统相结合,使得人们可以方便地将各种突变引入小鼠体内,得以从生物整体水平上研究高等真核生物基因的表达、调控及其生理功能.扼要介绍了近年来在小鼠胚胎干细胞进行基因打靶的研究进展.     

phbB,phbC基因克隆,序列分析及植物表达载体的构建

利用聚合酶链式反应技术,从真养产碱杆菌Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ Ｈ１６染色体ＤＮＡ中的主增并克隆了调控聚－β－羧基丁酸生物合成的两个关键酶基因;依赖ＮＡＤＰＨ的乙酰乙酰ＣｏＡ还原酶基因和ＰＨＢ合成酶基因。限制性内切酶图谱和核苷酸序列分析证实了克隆结果,并表明所克隆的基因与国外报道的有很高的同源性。     

基因转移与肿瘤基因工程疫苗

综述了近年来有关利用基因转移技术修饰肿瘤细胞制备肿瘤基因工程疫苗的最新研究进展,着重阐述了逆转录病毒载体介导的基因转移及其安全性;归纳了目前可用于肿瘤基因工程疫苗的各种目的基因的特点及作用并对这类肿瘤疫苗制备过程中所存在的问题进行了分析.     

克隆基因转入植物细胞的一般方法

本文介绍一种能将任何克隆基因转入植物细胞的方法,而不论其基因末端或中间的限制酶切点如何。已经构建了一种寄主范围很广的中间载体pGV1117,在其兰曙红着色的pTiC58质粒右端T-区片段含有Hind Ⅲ-23。利用EcoRI甲基化酶和EcoRI接头的连接在胞内所起的保护作用、将带有兔子β-珠蛋白基因的一段染色体DNA插入pGV1117质粒。转移到根瘤病土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中以后,通过体内重组把该基因插入pTiC58的T-区。受损伤的烟草幼苗被感染后,导致完整的珠蛋白基因作为T-DNA的一部分而转入植物基因组。虽然,在组织培养期间,这个基因能被稳定保留,但是在转化植株细胞中没有检测到β-珠蛋白特异的转录本。     

向基因疗法接近

今年夏天在给生来就患酶缺乏病人移植缺失基因的努力方面,向现实化迈进了一大步。加洲圣地亚哥的两个研究小组合作,试图以还原病毒为人基因的转移载体来恢复Lesch—Nyhan综合征病人的培养细胞中的酶合成作用。     

人表皮生长因子基因的化学合成和克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了人表皮生长因子基因,全长为173个核苷酸,它被分成8个寡核苷酸,分别在DNA合成仪上合成。经分离纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接,然后被克隆到噬菌体M13mpl8中,克隆经分子杂交、限制酶酶切以及DNA序列分析检测,证明合成的人表皮生长因子基因和设计的完全一致。将人表皮生长因子基因的DNA片段插入酵母分泌型表达载休YFD59 HindⅢ位点中,建成表达人表皮生长因子基因的质粒YFDl04,再将此质粒转化酿酒酵母,所得转化子经摇瓶发酵,发酵上清液用受体结合试验表明有人表皮生长因子表达。     

应用杆状病毒载体在昆虫细胞系统中表达乙型肝炎病毒表面抗原基因

构建了同时带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体质粒pVL941lacHBS。应用磷酸钙沉淀技术将pVL941lacHBS DNA转入事先用AcNPV感染过的Sf9细胞,在显色剂X-gal存在下,筛选无多角体的蓝色蚀斑。经过若干次蚀斑纯化,最后获得含乙肝病毒表面抗原基因和β-半乳糖苷酶基因的重组杆状病毒R-AcV941LS。 用R-AcV941LS感染Sf9细胞,在感染后72～96小时,用RPHA和RIA分别检测组织培养上清液和细胞裂解液中的乙型肝炎病毒表面抗原含量。结果,组织培养上清液为3.83μg/1×10~6～2×10~6细胞;细胞裂解液为4.39μg/1×10~6～2×10~6细胞。乙型肝炎病毒表面抗原的合成总量为8.22μg/1×10~6～2×10~6细胞。免疫电镜观察显示表达产物呈约22nm的球形颗粒。小鼠免疫接种实验结果表明,以R-AcV941LS感染Sf9细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原与在哺乳动物细胞系表达的乙型肝炎病毒表面抗原具有相近似的免疫原性。