光控诱导重组系统的开发与应用

位点特异性重组系统由重组酶和特异性识别位点两部分组成,是一种强大的基因操作工具,被广泛运用于生命科学研究。已开发的诱导型重组系统以时空方式精准调控细胞和动物的基因表达,被用于基因功能研究、细胞谱系示踪和疾病治疗等领域。根据诱导重组酶时空表达方式的不同,诱导型重组系统可分为化学诱导和光控诱导两种方式。光控诱导重组系统是利用光作为诱导剂,根据光控方式和对象的不同,可进一步分为光笼和光遗传学两类。光笼诱导重组系统是利用光敏基团来控制化学诱导剂或重组酶,光诱导前它们的活性被光敏基团抑制;在特定光照射后,它们的活性被恢复,进而实现光控诱导基因重组。光遗传学诱导重组系统是通过光遗传学开关介导分割型重组酶的重新激活来诱导基因重组。其中光遗传学开关由一系列基因编码的光敏蛋白组成,包括隐花色素、VIVID蛋白、光敏色素等。这些类型丰富的光控诱导重组系统为从高时空分辨率的维度解析基因的表达和功能提供了更多的工具,以满足日益复杂的生命科学研究需求。本文主要对不同类型光控诱导重组系统的开发原理及应用进行综述,比较其优缺点,最后对未来开发更多光控重组系统进行展望,旨在为系统优化升级提供理论基础和指导。     

卡托普利所致肾脏损害：肾小球入球动脉对血管紧张素Ⅱ反应和炎症信号的相关研究（英文）

卡托普利可表现出一定的肾毒性作用,主要是源于该药物会造成肾素的累积和血管紧张素Ⅱ (angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)的逃逸。本研究主要目的是探究血管紧张素转换酶1抑制剂卡托普利是否通过改变肾入球动脉对Ang Ⅱ的反应,同时激活炎性信号通路而损伤肾脏。用卡托普利(每天60 mg/kg)喂养C57Bl/6小鼠四周,其中后两周用皮下植入Ang Ⅱ (400 ng/kg per min)微泵注射建立高血压小鼠模型。模型建成后,用PAS (periodic acid-Schiff)及Masson染色评估肾脏的病理改变,用FITC标记的菊粉清除率检测肾小球滤过率,用体外入球动脉灌注方式检测入球动脉对Ang Ⅱ反应,用试剂盒检测肾小球前小动脉(preglomerular arterioles)的过氧化氢、过氧化氢酶水平和血浆肾素水平,用RT-qPCR检测肾皮质转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β),环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2)和肾小球前小动脉血管紧张素受体mRNA表达水平。结果显示,与溶剂组小鼠相比,卡托...     

高产青霉素酰化酶巨大芽胞杆菌的诱变选育及产酶条件优化

【目的】选育高产青霉素G酰化酶(PGA)工业菌株。【方法】采用LiCl-紫外线复合诱变以及常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) ATCC 14945进行处理。处理菌体涂平板后,将长出的菌落接种到液体培养基中,向培养6 h后的二代菌液中添加终浓度为0.1%的苯乙酸,28 °C、250 r/min条件下诱导培养40 h。对离心后获得的上清(粗酶液)采用NIPAB法测定PGA酶活力。以PGA酶活力最高的菌株为材料,对苯乙酸最佳添加量和最佳诱导时间进行优化,采用NIPAB法测定PGA酶活力。采用SDS-PAGE检测诱变前后巨大芽胞杆菌粗酶液中PGA的蛋白特性。【结果】从诱变菌落中筛选到PGA酶活力为39.60 U/mL的菌株12-4,酶活力比出发菌株提高了8.5倍。该菌株在液体培养6 h后添加终浓度为0.2%的苯乙酸,继续培养50 h后,PGA酶活力可达78.45 U/mL,比出发菌株提高了16.8倍。诱变前后菌株培养液中的PGA蛋白均具α、β亚基;诱变后菌株PGA α亚基的量没有明显变化,β亚基的量明显增多;α、β亚基之间的蛋白条带明显增多。【结论】采用诱变技术可提高巨大芽胞杆菌PGA活性,获得的诱变菌株12-4及培养条件对PGA工业化生产具有重要价值。     

绿色木霉对小球藻细胞壁的酶解作用

【目的】探讨绿色木霉分泌液能否分解小球藻细胞壁。【方法】用海藻酸钠和氯化钙固定绿色木霉,游离绿色木霉和固定化绿色木霉分别培养一段时间,离心培养液,用分光光度计法检测上清液中纤维素酶活性。在上清液中加入浓缩的小球藻悬浮液,用显微镜计数细胞壁破碎的小球藻。【结果】绿色木霉能同时分泌内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-1,4葡萄糖苷酶3种纤维素酶,其中外切葡聚糖酶活性最高。固定化绿色木霉反复使用5次后,分泌的纤维素酶活性能保持到初次的67.4%。市售纤维素酶、游离绿色木霉、固定化绿色木霉初次及第5次分解小球藻细胞壁的效率分别为47.3%、86.5%、81.5%、52.1%。【结论】市售纤维素酶、游离绿色木霉、固定化绿色木霉都能分解小球藻细胞壁,其中固定化绿色木霉因可重复使用,具有潜在的应用前景。     

多聚磷酸盐在细菌和哺乳动物细胞中的作用

多聚磷酸盐(Poly P)广泛分布于真核生物和原核生物中,是由几十个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体。Poly P能影响细菌的毒力,有助于细菌抵抗环境中的压力刺激。在真核细胞中,Poly P与核仁的转录相关,可促进凝血和细胞分化、调节促炎反应,并和骨的重构、矿化及去矿化相关。同时,Poly P也是线粒体通透性转换孔的激活物。本文综合阐述Poly P在微生物及哺乳动物中的作用及相关机制,同时结合我们的研究工作,分析Poly P对大肠杆菌致病性的影响,以期引起研究者对Poly P的关注。     

棘孢曲霉固态发酵柚皮产柚苷酶的条件优化

【目的】以柚皮为原料,优化棘孢曲霉利用柑橘加工副产物固态发酵柚苷酶的条件。【方法】采用高效液相色谱法检测酶活力,通过单因素试验考察固水比、装样量、接种量、温度对柚苷酶发酵的影响,用正交试验优化发酵条件。【结果】单因素试验结果的显著性分析表明培养基的固水比、装样量和培养温度对柚苷酶产量有显著性影响,而接种量影响不显著;经正交试验确定的优化条件是：固水比1:1 (质量体积比),装样量5 g/250 mL三角瓶,温度为30 °C,接种1 mL孢子悬浮液,发酵8 d。在此优化条件下,柚苷酶酶活力为8.19 IU/g干物质,比初始培养基产柚苷酶活力提高7.38倍。【结论】通过对固水比、装样量和发酵温度进行优化,大幅度提高了棘孢曲霉固态发酵柑橘加工副产物的柚苷酶产量,为柚苷酶的生产提供了一种高产发酵工艺。     

临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布及其与毒力基因的关系

【目的】了解临床分离志贺菌中CRISPR/Cas系统的分布特征并分析其与毒力基因的关系。【方法】以聚合酶链式反应(PCR)方法,采用10对引物分别对57株临床分离志贺菌中CRISPR1、cas2-cas1、cas6e-cas5、cas7、cse2、cse1-cas3基因和毒力基因ipaH、ial、ipaBCD、virA进行检测。对CRISPR1的PCR结果进行测序,并用CRISPR finder在线软件对CRISPR1基因座进行分析。通过卡方检验初步分析CRISPR/Cas系统与毒力基因的关系。【结果】测序结果显示,CRISPR1基因座中间隔序列数目较少且在不同菌株间一致性较高;57株志贺菌中,84.2% (48/57)的志贺菌中可检测到CRISPR/Cas系统,其中68.8% (33/48)的志贺菌中cas6e-cas5基因或(和) cse2基因中发现插入序列;毒力基因ipaH、ial、virA、ipaBCD的检出率依次为100%、100%、98.2%和87.7%;毒力基因ipaBCD的阳性率与活性CRISPR/Cas系统的分布无关(P>0.05)。【结论】CRISPR/Cas系统广泛存在于临床分离志贺菌中;部分cas基因中有插入序列;并未发现志贺菌中活性CRISPR/Cas系统与毒力基因的分布有关。     

鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶的基因克隆、表达及最适反应pH改造

【目的】表达鱼腥藻苯丙氨酸脱氨酶(AvPAL),并经分子改造降低其最适反应pH。【方法】PCR克隆AvPAL编码基因,并在大肠杆菌中表达,用Ni2+亲和层析柱和凝胶柱纯化重组蛋白。利用GETAREA软件筛选与催化残基距离较近的暴露于酶分子表面的氨基酸位点,将其突变为带电性质不同的氨基酸,并对突变体进行酶学性质研究。【结果】在大肠杆菌中成功表达了AvPAL,纯化后得到电泳纯的重组酶。突变体E75Q和E75R的最适反应pH从8.5分别偏移到7.5和7.0。E75Q在pH 7.5时的比酶活较原酶提高了25%,在pH 6.5–9.5之间酶的稳定性良好,其最适反应温度为50 °C,在此温度下保温1 h酶活无显著变化。在最适反应条件下,E75Q的kcat/Km值较原酶提高了26.6%。【结论】改变AvPAL酶分子中起路易斯碱作用的关键氨基酸残基(质子受体)附近与之有相互作用的氨基酸的带电性质,降低了AvPAL的最适反应pH,提升了其在医疗领域的应用前景。     

几种耐热戴氏霉对秸秆的降解效果

【目的】测定6株戴氏霉(Taifanglania)的生长温度特性及其对秸秆的降解效果。【方法】通过定时测定不同培养温度下的菌落直径绘制6株戴氏霉菌株的生长曲线;采用苯胺蓝法、愈创木酚法和木质素磺酸钙降解试验测定其木质素降解能力;用羧甲基纤维素钠水解圈测定法和胞外酶活测定法判定其对纤维素的降解能力;以失重法和范氏洗涤剂法检测其对水稻秸秆的降解效果。【结果】所试的耐热戴氏霉菌株均能耐受50 °C的高温,并能产生纤维素酶,但不同菌株产生的木质素降解酶有所差异;均具有降解秸秆的能力,其中合川戴氏霉(T. hechuanensis) H08.1菌株降解能力最强,其次是灰戴氏霉(T. cinerea) H57.1菌株,其秸秆降解率分别为50.2%和42.2%。【结论】合川戴氏霉H08.1菌株和灰戴氏霉H57.1菌株在秸秆的降解利用上具有潜在开发价值。     

高产几丁质酶巴伦葛兹类芽孢杆菌的筛选和发酵条件优化

【目的】鉴定一株来源于中国南海海水样能够分泌多种胞外几丁质酶的类芽孢杆菌CAU904,并优化其产几丁质酶的发酵条件。【方法】采用形态学观察、16S r DNA序列比对及生理生化实验鉴定;通过碳源、氮源、温度、初始p H、表面活性剂种类以及发酵时间的单因素优化实验获得最佳发酵条件。【结果】菌株CAU904被鉴定为巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii),其最优发酵产酶条件为:0.5%胶体几丁质,0.2%酵母浸提物,0.1%吐温-80,培养基初始p H 7.0,45°C培养72 h。在最优发酵条件下,该菌株最大产酶水平达到8.2 U/m L,比优化前提高了5.4倍。几丁质酶的酶谱分析表明该菌株能够产生多达11种具有几丁质水解活性的同工酶,其中主要酶谱带对应分子量分别为54、47和38 k D。【结论】实验结果为巴伦葛兹类芽孢杆菌几丁质酶的分离纯化和酶的应用提供了基础。