CRISPR/Cas系统与志贺菌毒力和耐药的关系及插入序列IS600对cse2表达水平的影响北大核心CSCD

【目的】了解志贺菌中成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的分布及其与毒力和耐药的关系,并分析志贺菌中插入序列IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【方法】利用课题组前期设计的引物PCR扩增志贺菌的3个CRISPR位点、CRISPR相关蛋白基因cse2、耐药基因和毒力基因;改良Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行药敏试验;台盼蓝计数试验检测细菌毒力;Real-time PCR检测志贺菌中cse2基因m RNA表达水平。分别分析志贺菌中CRISPR/Cas系统与耐药基因、耐药表型、毒力基因、毒力表型的关系;了解IS600对CRISPR相关蛋白基因cse2 m RNA表达水平的影响。【结果】志贺菌中CRISPR1位点阴性细菌的毒力强;插入序列IS600使cse2 m RNA表达水平降低。【结论】志贺菌中存在CRISPR1、2、3位点;CRISPR1位点与毒力有关;插入序列IS600对cse2 m RNA表达水平有影响。     

汉中市中心医院细菌性痢疾志贺菌16S rRNA序列分析、毒力基因与耐药检测

目的对汉中市中心医院细菌性痢疾患者分离的70株志贺菌进行16S rRNA序列分析、毒力基因与耐药检测。方法对2018年6月至2018年12月我院收治的细菌性痢疾患者进行病原菌分离鉴定,并进行16S rRNA遗传进化分析;PCR法检测其6种毒力基因;K-B法检测其对8种抗生素的敏感性。结果 16S rRNA测序结果显示,福氏志贺菌感染率为57.14%(40/70),宋内志贺菌感染率为42.86%(30/70)。16S rRNA系统进化分析结果显示,40株福氏志贺菌与参考菌株(NR_026331.1)同源性为95.2%～99.0%,30株宋内志贺菌与参考菌株(NR_104826.1)同源性为96.3%～99.9%。毒力基因检测结果表明,70株志贺菌均可以检测出6个相关毒力基因set1A、set1B、sen、Ial、ipaH、virA,毒力基因检出率最高的为ipaH,达到100.00%,其次为Ial、virA,均达到90.00%;其中福氏志贺菌set1A、set1B、Ial基因的检出率高于宋内志贺菌,sen和virA基因的检出率低于宋内志贺菌,二者ipaH基因的检出率都为100.00%。药敏试验结果表明,70株志贺菌耐药率最高的抗生素为氨苄西林,耐药率达到80.00%,其次为强力霉素,耐药率达到75.71%,耐药率最低的为头孢吡肟,耐药率为20.00%;其中40株福氏志贺菌耐药率最高的抗生素为强力霉素,其次为氨苄西林,最低的为头孢吡肟;30株宋内志贺菌耐药率最高的抗生素为氨苄西林,其次为哌拉西林,最低的为氧氟沙星。结论 2018年下半年汉中市中心医院从细菌性痢疾患者身上分离得到的志贺菌主要为福氏志贺菌与宋内志贺菌,毒力基因检测和耐药性试验结果显示分离菌株有较强致病性,提示对细菌性痢疾的监测、防控与治疗应进一步加强。     

创伤弧菌TF3全基因组包含的CRISPR-Cas系统及MGIVvuTF3基因岛分析

【目的】分析创伤弧菌(Vibrio vulnificus)全基因组框架序列,挖掘感兴趣的遗传位点,探索其是否具有CRISPR系统及其特征。【方法】在病虾体内分离获得了一株创伤弧菌TF3,通过Illumina Miseq测序得到基因组框架序列。经注释分析发现其基因组中存在一个CRISPR-Cas系统,命名为CRISPR-CasTF3,进一步分析发现CRISPR-CasTF3位于一个基因岛上,将该基因岛命名为MGIVvu TF3。对CRISPR-CasTF3及MGIVvu TF3的特征和来源进行了分析。【结果】CRISPR-CasTF3属于与大肠杆菌类似的Ι-E型CRISPR-Cas系统,CRISPR-CasTF3包括8个cas基因,其排列为cas3-cas8e-cse2-cas6-cas7-cas5-cas1-cas2;具有50个重复序列,每二个重复序列间为一个Spacer序列。MGIVvu TF3具有att L和att R序列,含有位点特异性整合、剪切、转移相关的基因。MGIVvu TF3与霍乱弧菌O395基因组中的一个基因岛MGIVch0395具较高相似性,二者最显著的差别在于Spacer序列完全不同,以及各有几个非保守的预测基因。【结论】MGIVvu TF3及CRISPR-CasTF3极有可能通过基因水平转移获得,并且CRISPR-CasTF3系统可以借助MGIVvu TF3实现水平转移。     

一株牛源都柏林沙门氏菌的全基因组测序及毒力与耐药性分析

【背景】沙门氏菌(Salmonella spp.)是重要的人畜共患病原菌,其毒力和耐药性的不断增强引起广泛关注。【目的】了解从通辽市一犊牛死亡病例中所分离牛源都柏林沙门氏菌的毒力及耐药性情况。【方法】以病死犊牛肺脏为材料,经细菌分离纯化及16S rRNA基因测序,鉴定病原为沙门氏菌。采用动物试验、药敏试验和PCR方法对分离菌进行毒力、耐药性,以及毒力基因和耐药基因检测,并对其进行全基因组测序分析。【结果】分离菌具有较强毒力,对小鼠半数致死量为2.8×10⁶ CFU/mL。分离菌为多重耐药菌,仅对多粘菌素B和噻孢霉素敏感,对强力霉素和恩诺沙星中度敏感。检测13种沙门氏菌常见毒力基因,检出率为92.3%。对分离菌进行全基因组测序分析,该菌株为都柏林沙门氏菌,基因组大小为4 965 370 bp,GC含量为52.12%,同时携带2个质粒,大小分别为79 524 bp (pTLS-1)和45 301 bp (pTLS-2)。分离菌中共携带996个毒力基因和24个毒力岛;共携带42个耐药基因,其中4个为可水平转移基因,基因组中存在9个可移动遗传元件,包括插入序列和转座子等。【结论】分离牛源都柏林沙门氏菌菌株具有较强毒力且为多重耐药株,携带大量毒力基因及耐药基因。     

志贺菌CRISPR的检测及其与耐药的关系

【目的】检测志贺菌成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),并分析其与志贺菌耐药的关系。【方法】根据CRISPR DB数据库公布的志贺菌确定的CRISPR结构序列CRISPR-S2、CRISPR-S4和可能的CRISPR结构序列CRISPR-S1、CRISPR-S3设计四对引物,对60株志贺菌进行PCR扩增。采用CRISPR Finder分析CRISPR,采用改良K-B药敏纸片法检测志贺菌耐药情况,并分析CRISPR-S4与耐药的关系。【结果】确定的CRISPR结构的总阳性率为95%,四个CRISPR位点组成12种CRISPR谱型(A-L),除K型外均含确定的CRISPR结构,新发现1种重复序列和12种间隔序列。60株志贺菌的多重耐药率为53.33%。CRISPR-S4阳性菌株与阴性菌株之间,耐药的分布差异无统计学意义,但多重耐药菌株和耐TE菌株CRISPR-S4的重复序列多为R4.1,其3’末端缺失碱基AC;多重耐药菌株CRISPR-S4的间隔序列多为Sp5.1、Sp6.1和Sp7。【结论】CRISPR在志贺菌中广泛分布。CRISPR重复序列的变异和间隔序列的多样性可能与志贺菌耐药有关。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株

【目的】利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除anxa6基因的Caco-2细胞株,为研究大肠杆菌O157:H7效应蛋白Esp F与宿主膜联蛋白A6 (ANXA6)相互作用及其致病机制奠定基础。【方法】根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别anxa6基因的向导RNA (single guide RNA,sgRNA),基于Lenti CRISPRv2载体构建Lenti CRISPRv2-sg RNA重组质粒,转入293T细胞中,制备sgRNA-Cas9慢病毒,将慢病毒感染Caco-2细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞,有限稀释法分离培养单克隆细胞,提取单克隆细胞基因组DNA,并对敲除位点附近的DNA片段进行PCR扩增,测序并进行脱靶效应评估;免疫印记法检测ANXA6蛋白表达情况,细胞计数试剂盒8 (cell counting kit 8,CCK8)试剂盒检测细胞增殖能力,免疫荧光法检测细胞紧密连接分布情况。【结果】Western blotting及序列测序表明anxa6基因敲除单克隆细胞构建成功;脱靶效应评估结果显示预测的10个脱靶位点均无脱靶现象;基因敲除对细胞增殖能力...     

沙门氏菌CRISPR位点的结构特征比较

成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR),是存在于多数细菌和古菌中的遗传结构,能够有效防御外源DNA的入侵(质粒、噬菌体等),进而防御外源基因的水平转移。【目的】本研究以沙门氏菌属中常见的鸡伤寒沙门氏菌(Salmonella gallinarum)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)以及肠炎沙门氏菌(salmonella enteritidis)等30个菌株为研究对象。探索CRISPR位点在不同沙门氏菌种中的结构差异。【方法】通过生物信息学的方法比较间隔序列与插入序列的同源性以及CRISPR位点与质粒数量关系。【结果】30株沙门氏菌中均存在CRISPR结构,包括CRISPR位点61个以及可疑位点12个。重复序列和cas1基因均不能作为这4类细菌的分类依据。【结论】虽然我们发现CRISPR位点数量与间隔区数量和质粒数量之间均不存在统计学关系,但间隔序列整合子、耐药基因等移动遗传原件具有一定的同源性,说明沙门氏菌在进化过程中不断受外源基因的侵袭。     

腾冲嗜热厌氧杆菌Cas2原核表达及生物信息学分析

为研究CRISPR/Cas系统及其相关蛋白Cas2(TTE2657)在腾冲嗜热厌氧杆菌热适应中的作用,应用PCR技术构建了原核重组质粒pET-28a::cas2,并在大肠埃希菌BL21表达Cas2蛋白;结合生物信息学软件对cas2编码蛋白的基本理化性质、氨基酸同源性、空间结构及蛋白质相互作用网络进行预测和分析。结果显示,成功构建了原核表达载体pET-28a::cas2并在大肠埃希菌BL21中得到表达,Cas2分子质量大小为9.9 ku,主要以可溶性形式存在;qRT-PCR显示cas2 mRNA在60℃和75℃高表达;生物信息学分析显示cas2基因其完整的ORF全长264 bp,编码88个氨基酸,其中Ile(14)、Ser(14)、Phe (12)含量较高,等电点为9.31,不存在跨膜结构。其蛋白质二级空间结构以α-螺旋、无规则卷曲、β-折叠为主,蛋白互作预测网络显示Cas2与Cas3、Cas5、Cas7等其家族大部分蛋白存在相互作用。进化树分析显示腾冲嗜热厌氧杆菌cas2基因与厌氧菌芽胞杆菌B7M1同源性最高(39.5%)。腾冲嗜热厌氧杆菌cas2编码蛋白是一种亲水性蛋白,在原核系统能高效表达。本研究为嗜热蛋白质的热稳定性机制的研究提供参考。     

家蚕β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1的CRISPR敲除载体的构建与导入

【目的】CRISPR/Cas9是近些年报道较多的基因编辑新工具,具有简便高效、特异性强等优势。BmSuc1是从鳞翅目经济昆虫家蚕Bombyx mori体内发现的编码β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase,β-FFase)的基因,也是首个被克隆和鉴定的动物型β-FFase编码基因。β-FFase是作用于果糖基的蔗糖水解酶,BmSUC1可能与家蚕防御桑叶生物碱的生理过程有关,但目前其发挥作用的分子机制尚不清晰。为了解析BmSuc1在蚕体的作用途径及其生理功能,本研究基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建表达双元sgRNA的CRISPR载体,用于敲除家蚕基因组中的BmSuc1基因。【方法】根据目的基因BmSuc1的ORF序列设计2条sgRNA,通过同源重组的方法分别插入CRISPR载体的Sal I和Nhe I酶切位点。进而利用转基因显微注射技术将该编辑载体注入G_0代蚕卵,经催青孵化饲养家蚕并自交制备G_1代蚕种。【结果】PCR验证及测序结果均表明CRISPR编辑载体构建成功。根据Ds Red2红色蛋白的荧光标记,从G_1代家蚕幼虫中成功筛选出阳性转基因个体。【结论】本文详细介绍了表达双元sgRNA的CRISPR载体的构建方法,所获得的阳性转基因家蚕对于下一步探讨BmSuc1在家蚕糖类营养的吸收与利用途径中的作用奠定了重要的实验基础,有助于阐明蚕-桑相互选择和适应的分子机制。     

运用CRISPR/Cas9技术敲除人源黏着斑蛋白基因

目的:建立CRISPR/Cas9n系统,用于敲除人源黏着斑蛋白(VCL)基因。方法:设计一个靶向人源VCL基因第3个外显子的单向导RNA(sgRNA),分别克隆表达载体后,通过慢病毒转入人MDA-MB-231细胞,通过PCR及Western印迹检测细胞株中VCL基因的敲除效果。结果:测序结果显示靶向VCL基因CRISPR/Cas9重组质粒构建成功;PCR产物测序结果表明本次设计的Cas9/sgRNA能够对VCL基因进行编辑敲除;Western印迹显示Cas9-VCL组的MDA-MB-231细胞内VCL表达水平较对照组显著降低。结论:通过CRISPR/Cas9系统获得了靶向VCL基因的重组质粒,构建的重组质粒能有效敲除VCL。     

Curcuminoids as inhibitors of thioredoxin reductase: A receptor based pharmacophore study with distance mapping of the active site

Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.     

A Unique Protease Cleavage Site Predicted in the Spike Protein of the Novel Pneumonia Coronavirus (2019-nCoV) Potentially Related to Viral Transmissibility

正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases     

Comparative morphology of the carpel in the Liliaceae: Hewardieae, Petrosavieae, and Tricyrteae

The young pistils in the melanthioid tribes, Hewardieae, Petrosavieae and Tricyrteae, are uniformly tricarpellate and syncarpous. They lack raphide idioblasts. All are multiovulate, with bitegmic ovules. The Petrosavieae are marked by the presence of septal glands and incomplete syncarpy. Tepals and stamens adhere to the ovary in the Hewardieae and the Petrosavieae but not in the Tricyrteae. Two vascular bundles occur in the stamens of the Hewartlieae and Tricyrtis latifolia. Ventral bundles in the upper part of the ovary of the Hewardieae are continuous with compound septal bundles and placental bundles in the lower part. Putative ventral bundles occur in the alternate position in the Tricyrteae and putative placental bundles in the opposite. position in the Petrosavieae. The dichtomously branched stigma in each carpel of the Tricyrteae is supplied by a bifurcated dorsal bundle.     

鸡传染性法氏囊病病毒研究进展

传染性法氏囊病(Infection bursal disease, IBD)是由鸡传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种高度接触性传染病,给世界各国的禽养殖业带来了巨大损失.自IBDV发现至今新的变异株不断出现,分子结构的改变导致病毒致病力的改变及宿主对疫苗应答的改变,使得传统的疫苗已不能控制其流行,因此各国学者对其基因组结构和功能进行了广泛深入的研究,并积极研制新型有效的疫苗以达到防治的目的.     

Development of a Novel Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification Method for Rapid Detection of SARS-CoV-2

In conclusion, the novel visual RT-LAMP assay is a simple, rapid, and sensitive approach for detection of SARS-CoV-2, and it is ready for application in primary care and community hospitals or health care centers, and even patients' own houses in response to the current SARS-CoV-2 epidemic because the assay does not require sophisticated equipment and skilled personnel. Furthermore, it is also ready to be used in fields for screening samples from wild animals and environments to facilitate the identification of potential intermediate hosts that mediate the cross-species transmission of SARS-CoV-2 from bats to humans.     

Perinatal Vertical Transmission of Chikungunya Virus in Ruili,a Town on the Border between China and Myanmar

正Dear Editor,Chikungunya virus (CHIKV), an arbovirus in the family of Togaviridae, genus Alphavirus, is transmitted by the A.aegyptii or A. albopictus mosquito, and causes disease in humans characterized by fever, rash, and arthralgia (Silva and Dermody 2017; Suhrbier 2019). It was first reported in 1953 in Tanzania, and caused only a few outbreaks and sporadic cases in Africa and Asia in last century. However, in the epidemic in 2004, CHIKV acquired mutations that conferred enhanced transmission by the A. albopictus mosquito(Schuffenecker et al. 2006). Since then, it has successively caused outbreaks in Africa, the Indian Ocean, South East Asia, the South America, and Europe (Zeller et al. 2016).