中枢神经系统靶向性Mn-SOD的克隆和在大肠杆菌中的表达研究

靶向性超氧化物歧化酶(SOD)是治疗氧自由基引起神经细胞损伤所致疾病等的有效途径.将破伤风毒素C部分（tetanus toxin fragment C,TTC）基因与编码Mn-SOD的cDNA融合克隆进pET-22b(+)载体,1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导在大肠杆菌中表达.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)图谱可见约71 ku有表达产物条带,与理论计算值相符;蛋白质印迹（Western blot）分析显示,表达产物与抗Mn-SOD及破伤风毒素的多抗有免疫反应,而且表达产物用邻苯三酚自氧化法测定具有SOD活性.融合蛋白可作为有效的试剂靶向性输送Mn-SOD到神经元细胞,这为进一步研究靶向性SOD的治疗中枢神经系统的相关疾病提供了基础.     

昆虫杆状病毒表达系统研究进展

本文概括了昆虫杆状病毒的生物学、基因组结构和调控方面取得的进展,并对该载体系统的构建及外源基因的表达等研究作了评述。     

乙肝病毒s基因在家蚕细胞及蚕体内高效表达

把人乙型肝炎病毒(adr)的表面抗原S基因插入到家蚕核型多角体病毒基因组中,构建了重组病毒BmNPVS。用重组病毒感染家蚕细胞,测得每毫升培养物(1×10⁶细胞)HBsAg表达量达35．5μg;感染家蚕幼虫和蛹,经检测表明HBSAg产量平均为每头蚕约750μg,每只蛹约为690μg。初步纯化的表达产物经Westefn blotting和电镜观察证实,表达产物是直径为22nm的颗粒,并主要以糖基化形式存在。表达产物的浮力密度为1．2g／ml,与病人血清的HBsAg一致。     

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子,用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶,表达量达到５８０μｇ／条蚕,从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的,可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。     

霍乱弧菌zot基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

从霍乱疫苗菌中抽提基因组DNA,用PCR的方法扩增zot基因。序列分析表明,zot基因编码399个氨基酸,其中4个氨基酸与文献报道有差异。将zot基因插入含T7启动子的质粒pET28(a+)构建表达质粒pET-ZOT,转化大肠杆菌BL21(DE3)筛选表达菌株BLZOT。表达菌株经1mmol/L IPTG诱导表达3～5h后,表达大量ZOT蛋白,并形成包涵体。经SDS-PAGE分析重组ZOT蛋白分子量约为47kD,凝胶自动扫描分析表明,重组ZOT约占菌体可溶性蛋白量的15%以上。本工作为进一步研究蛋白多肽类药物的口服奠定了良好的基础。     

日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫cDNA文库的构建

用TRIZOL试剂盒分别提取日本血吸虫中国大陆株雌、雄成虫总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第一链cDNA,完成第二链cDNA合成后,凝胶电泳回收500bp以上的片段并过柱纯化后,与载体λZipLox连接。体外包装后分别得到雌、雄成虫cDNA噬菌体表达文库。经测定雌、雄文库容量分别为3.74×10⁶、3.28×10⁶,重组比率均在96%以上,插入片段长度多在1kb左右。通过PCR技术,我们从文库中钓取到EGP、23kD膜蛋白、Actin和GCP的cDNA,其中GCP基因为低丰度表达基因。各项指标表明,我们成功构建了高质量的cDNA文库,可作为研究雌雄成虫基因差异及筛选保护性抗原基因的重要资源。     

破骨细胞形成抑制因子研究进展

破骨细胞形成抑制因子（OPG/OCIF）是最近发现的一种参与调节骨密度的糖蛋白,是一个肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族的新成员,其氨基酸序列中具有TNF受体结构类似区.成熟的OPG/OCIF具有7个结构域,可分为三个功能区,即：TNF受体结构区、致死结构区和肝素结合区.OPG/OCIF基因定位在8q23～24上,由5个外显子和4个内含子组成,其表达受到与骨的形成和破坏有关因子的调控：如TGF-β1、1,25(OH)₂VD₃、TNF-α等等.OPG/OCIF抑制骨的破坏和吸收机制主要是抑制破骨细胞的存活,引起破骨细胞凋亡和抑制破骨细胞形成.     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2 (A .aBPLA2 )基因克隆至温敏表达载体 pBLMVL2 ,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达 .表达产物A .aBPLA2 约占细菌蛋白质总量的 2 0 % ,并以包涵体的形式存在 .纯化包涵体后 ,将产物变性、复性 ,然后用FPLCSuperoseTM12纯化 ,产物经过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带 .对纯化后的表达A .aBPLA2 进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定 .结果显示 ,表达A .aBPLA2的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A2 酶活性相近 ,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A2 的溶血活性 ,没有抑制血小板聚集活性 .最后对磷脂酶A2 的结构与这些活性的关系进行了讨论     

抗癌胚抗原单链抗体基因在家蚕细胞和幼虫中的表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单链抗体基因插入家蚕杆状病毒转移载体ｐＢａｃＰＡＫＨｉｓ, 与修饰的家蚕核型多角体病毒ＢｍＢａｃＰＡＫＤＮＡ共转染家蚕细胞, 经同源重组得到含有在多角体蛋白基因启动子控制下的抗ＣＥＡＳｃＦｖ 基因的重组病毒ＢｍＢａｃＳｃＦｖ。用重组病毒分别感染家蚕细胞和幼虫, 在两者中均得到了高效表达, 产物分子量为２８ｋＤ, 前者占细胞总蛋白的６ ％ , 后者为０ ．３ ｍｇ／ 蚕。目的基因在家蚕细胞和幼虫中表达产物经Ｎｉ２＋ＩＤＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂ亲和柱纯化, 前者纯度可达９０％ 以上, 后者纯度较低; 纯化后的融合蛋白具有ＣＥＡ 结合活力, 其亲和常数分别为５ ．４×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 和２．３ ×１０８／ｍｏｌ·Ｌ－１ , 略低于其亲本单抗Ｅ７Ｂ１０ ２．７ ×１０９／ｍｏｌ·Ｌ－ １ 。     

绢丝昆虫蛋白酶抑制剂研究进展

主要论述了绢丝昆虫体液蛋白酶抑制剂和茧丝蛋白酶抑制剂的分子生物学,遗传规律以及生理意义等,并展望绢丝昆虫蛋白酶抑剂的潜在应用前景。