日本血吸虫虫卵、童虫和雌雄成虫膜蛋白的双向电泳

血吸虫寄生生活复杂,中间宿主和终末宿主转换,有性繁殖和无性繁殖交替,由其感染引起的血吸虫病仍严重危害人畜健康(陈贤义等,2002).研究表明,血吸虫不仅能利用宿主的免疫信号分子伪装自己获得宿主的免疫兼容(Salzet et al.,2000),而且还在血吸虫中克隆到宿主信号分子的受体(Ahmed et al.,2001).     

日本血吸虫信号转导蛋白Sjwnt_4基因的克隆、表达及功能分析

由Wnt基因家族产物与其它相关基因产物构成的Wnt信号通路,是细胞发育和生长调节的一个关键途径,对动物的发育特别是生殖系统的发育起重要的调节作用。在人类和小鼠中,Wnt4蛋白是性腺分化过程中主要调节因子,在胚胎发育中起着关键作用。利用RACE技术从日本血吸虫19d童虫中首次扩增到一个Wnt家族基因,序列分析表明该基因的完整编码框含1311bp,编码436个氨基酸,理论分子量49.6kD。同源性分析结果表明,该基因的氨基酸序列具有典型Wnt家族蛋白特征,与日本三角涡虫、人Wnt4的氨基酸序列相似性分别达43％、37％,推测为血吸虫的Wnt4基因,命名为Sjwnt4（GenBank登陆号DQ643829）。实时定量PCR分析显示该基因在14d童虫、19d童虫、31d虫体、44d雌虫及44d雄虫中均有表达,其中19d童虫中的表达量明显高于其它发育阶段,44d雌虫中的表达量明显高于雄虫。构建了该基因的原核表达载体pGEX_4T_2_Sjwnt4,应用大肠杆菌系统进行了表达,表达蛋白以包涵体形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。Sjwnt4基因及其表达产物的获得,为探索Wnt信号通路对血吸虫发育、生殖的调节提供了重要基础。     

日本血吸虫期别差异表达基因文库的构建及分析

为从期别差异表达基因分析入手研究血吸虫的生长发育机制,应用抑制性消减杂交 (suppressed subtractive hybridization , SSH) 技术首次构建了日本血吸虫尾蚴、虫卵和成虫的期别差异表达基因文库 . 经消减效率分析和三种文库克隆的 EST 的期别差异性鉴定,表明所建文库质量较高,为在整个基因组水平分离血吸虫的差异表达基因提供了重要材料 . 由三个文库选择 257 个插入片段大于 500 bp 的克隆测定了 EST 序列 . 同源性分析结果表明 257 个 EST 代表 182 种血吸虫基因,其中有 22 种为血吸虫已知基因,有 128 种为血吸虫已知 EST ,有 32 种为新发现的血吸虫基因 . 对 EST 编码蛋白的功能预测结果显示：尾蚴消减文库的基因多与运动、能量代谢、转录调节及致病性相关;虫卵消减文库的基因可能参与信号转导、细胞粘附、蛋白质和碳水化合物的代谢以及抗氧化反应;成虫消减文库的基因多参与蛋白质的合成、转运及分解代谢,参与虫体的运动等 . 大规模分离、分析血吸虫期别差异表达基因将对从分子水平去解读血吸虫的生长发育机制,筛选高效疫苗候选抗原、药物靶标及诊断制剂有重要意义 .     

应用基因重组抗原诊断丙型肝炎研究

丙型肝炎病毒(Hepatis C virus,HCV)感染者的血液中病毒含量极低,还没有适当的方法可以直接检测病毒.现在常用免疫学方法测定特异性抗体[1]或利用PCR技术检测病毒核酸.由于HCV基因组变异高达33%,PCR检测易发生假阳性和假阴性.同时由于丙肝抗原高度的变异性[2],虽然目前ELISA方法应用广泛,但是单一的诊断抗原已不能满足临床要求,需要多价抗原联合应用作为诊断试剂.     

日本血吸虫真核翻译起始因子5基因的cDNA克隆和免疫保护功能分析

利用抑制削减杂交法筛选日本血吸虫雌雄虫差异基因,从中获得真核翻译起始因子5基因(eIF5)的 表达序列标。对该序列进行生物信息学分析:对其5’端进行电子延伸,获得含完整开放阅读框的cDNA序列 (AY686501)。将其亚克隆到表达载体pET-28c,进行重组表达。免疫保护效果实验表明,重组表达蛋白具有显著 抑制血吸虫卵在寄主肝脏中的沉积效果。     

血吸虫基因操作研究进展

近年来,血吸虫基因组、转录组、蛋白质组和分泌组研究广泛开展,迫切需要针对单个分子功能深入研究。开展血吸虫基因操作研究不仅可在虫体内深入研究基因功能,对进一步理解血吸虫生长发育机理和寄生生活特征具有重要意义,还可建立抗血吸虫候选疫苗和药物靶标筛选的重要平台。为此,本文总结基因操作技术在血吸虫学中的应用并分析其现状。     

丙型肝炎病毒CS,NS3 NS4 区抗原融合基因的构建及其在大肠杆菌中的表达

丙型肝炎病毒是与输血有关的非甲非乙肝病毒[1];是全世界输血后获得性肝炎的重要病因之一,并与急慢性肝炎、肝硬化和肝癌有关.由于主要通过输血的传播,会给人民的身体健康尤其输血事业带来极大危害.     

编码日本血吸虫抱雌沟蛋白及肌动蛋白的基因性别间的表达差异性

研究了所克隆的日本血吸虫两个基因的性别间的表达差异性。分别将所克隆到的编码日本血吸虫抱雌沟蛋白的cDNA(SjGCP1)和肌动蛋白的cDNA(SjAct)制成DNA探针,利用Southern blotting,Northern blotting和斑点印迹法对其相应基因性别间的表达差异性进行了研究。结果显示,日本血吸虫抱雌沟蛋白的基因在雄虫中转录而雌虫中不转录,血吸虫肌动蛋白基因在雄虫中转录量高于雌虫,表现出转录量的差异。证明这两个基因转录具有性别间的表达差异性。     

日本血吸虫中国大陆株22.6kD膜相关蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达*

以日本血吸虫mRNA为模板,用RTPCR法快速克隆到一大小约600bp的DNA片段,DNA序列分析证实,所扩增到的DNA片段中含有日本血吸虫22.6膜相关蛋白(Sj22.6(Ch))基因,将该基因重组到表达型质粒pGEX-4T中,表达的GST融合蛋白分子量约48kD,用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达40mg/L培养物,免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,为其在血吸虫病抗感染中的免疫作用研究创造了条件。     

日本血吸虫中国大陆株TPI基因的克隆及其表达产物特性

磷酸丙糖异构酶（ＴＰＩ）是血吸虫病疫苗重要的候选抗原基因之一。参考日本血吸虫已发表的ＴＰＩｃＤＮＡ序列,以日本血吸虫中国大陆株成虫ｍＲＮＡ为模板,用ＲＴ－ＰＣＲ法快速克隆出一大小约８００ｂｐ的ＤＮＡ片段。ＤＮＡ序列分析证实,所扩增到的ＤＮＡ片段即为日本血吸虫中国大陆株磷酸丙糖异构酶（ＳｊＴＰＩｃ）基因。将该基因重组到表达型质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ中,表达的ＧＳＴ融合蛋白分子量约５４ｋＤ。用谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化的重组蛋白不仅纯度好,而且得率高,纯化产量可达３０ｍｇ／Ｌ培养物。免疫试验结果表明该重组蛋白具有良好的抗原性,是一种较为理想的抗原分子。