盐酸胍诱导的α淀粉酶去折叠与再折叠

利用蛋白质内源荧光和酶活性两种信号以及荧光偏振,ＨＰＬＣ和停流等方法研究了盐酸胍诱导的α淀粉酶去折叠与重折叠的平衡转变和动力学。实验结果表明α淀粉酶去折叠与重折叠是两个不同的过程;变性与复性过程中可能伴有聚集体生成;去折叠与重折叠均为双相过程,重折叠大约始于２秒之后。     

重组白细胞介素2体外折叠的实验研究

包涵体中的重组蛋白抽提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的体外折叠（即复性）是基因工程下游处埋中的重要环节。荧光光谱研究表明,ＩＬ－２分子折叠过程中荧光强度逐渐减小,最大发射峰由３１６ｎｍ红移到３４８ｎｍ。以Ｔｒｐ残基的暴露程度反映分子的折叠状态。ＧＭ－ＣＳＦ在折叠过程中的荧光强度有类似变化;凝胶排阻ＨＰＬＣ可以检测折叠过程中的聚合体;而反相ＨＰＬＣ可以将ＩＬ－２分成三个相互独立的异构体色谱峰。据此可以计算出ＩＬ－２分子的正确折叠率。常用的稀释复性方法,随着ＩＬ－２浓度的增高,它的正确折叠率逐渐降低,蛋白浓度的对数与正确折叠率之间大致呈线性关系。当ＩＬ－２浓度为１ｍｇ／ｍＬ时,其正确折叠率仅为３０％,而采取较低的蛋白浓度进行复性会因大量的样品体积导致后期纯化的困难。     

嗜温冷休克蛋白力致去折叠研究

嗜温冷休克蛋白拥有一个由五个β股形成的反平行β桶结构,目前已被用于蛋白质去折叠的研究。当使用机械力对嗜温冷休克蛋白进行拉伸研究时,发现嗜温冷休克蛋白的去折叠过程具有明显的中间态。在常速和常力两种情况下对嗜温冷休克蛋白进行拉伸分子动力学模拟,发现其在两种情况下具有相同的去折叠次序,即C端β片层首先去折叠,随后N端β片层去折叠;同时这两种模拟都表现出明确的中间态。研究结果表明,嗜温冷休克蛋白抵抗外力作用除了依赖链间氢键外,分子内的静电相互作用也发挥着重要的作用。     

压强温度耦合作用下小蛋白去折叠过程的分子动力学模拟

在不同温度(280~540K)和压强(1×102~8×105 kPa)的耦合作用下,对GB1(the B1 domain of protein G)进行了56次独立分子动力学模拟,模拟时间达88.8 ns。在此基础上,研究了压强和温度对GB1去折叠过程的耦合效应。结果表明,压强对温度去折叠过程有明显影响,改变了蛋白质二级结构去折叠速度和蛋白质去折叠过程发生事件的先后次序。相同温度下,GB1的α-螺旋和β-折叠的稳定性随压强增大而提高;可及性表面积和其它结构特性参数随压强增大而减小。适度的压强(如2×105 kPa)会抑制温度导致的GB1二级结构去折叠速度,而更大的压强(如8×105 kPa)又加速了GB1的去折叠速度。在模拟的温度范围,当压强为100和2×105 kPa时,GB1疏水核协同暴露于水,而5×105和8×105 kPa时没出现此现象,这与最近的高压变性实验结果一致。     

胰岛素的体外折叠: 折叠中间体的鉴定 及其折叠途径

在单链胰岛素体外折叠研究的基础上, 研究了胰岛素的体外折叠过程. 在胰岛素的折叠过程中捕捉到6个主要的折叠中间体, 分别命名为P1A, P2B, P3A, P4B, P5B和P6B. 中间体的折叠实验证明6个中间体都能最终折叠成胰岛素. 在中间体的鉴定和分析以及推断的过渡态中间体形成和作用的基础上, 提出了胰岛素体外折叠的两步折叠途径. (ⅰ) 在折叠过程的早期, 完全还原的胰岛素, 即A链和B链各自形成中间体: 2个A链中间体(P1A和P3A), 4个B链中间体(P2B, P4B, P5B和P6B). (ⅱ) 在进一步的折叠过程中, 推断相继产生3个过渡态中间体: 首先, 中间体P3A通过分子内巯基/二硫键交换反应形成过渡态中间体Ⅰ, 该中间体含有1个天然二硫键A6-A11和2个巯基分别位于A7和A20; 然后, 过渡态中间体Ⅰ的巯基和P4B或P6B上的巯基通过氧化反应(主要以折叠体系中的GSSG为氧化剂)分别形成含有2个天然二硫键的过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ; 最后, 过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ通过分子内巯基/二硫键交换反应形成第3个天然二硫键, 完成胰岛素体外折叠.     

胰岛素的体外折叠: 折叠中间体的鉴定 及其折叠途径

在单链胰岛素体外折叠研究的基础上, 研究了胰岛素的体外折叠过程. 在胰岛素的折叠过程中捕捉到6个主要的折叠中间体, 分别命名为P1A, P2B, P3A, P4B, P5B和P6B. 中间体的折叠实验证明6个中间体都能最终折叠成胰岛素. 在中间体的鉴定和分析以及推断的过渡态中间体形成和作用的基础上, 提出了胰岛素体外折叠的两步折叠途径. (ⅰ) 在折叠过程的早期, 完全还原的胰岛素, 即A链和B链各自形成中间体: 2个A链中间体(P1A和P3A), 4个B链中间体(P2B, P4B, P5B和P6B). (ⅱ) 在进一步的折叠过程中, 推断相继产生3个过渡态中间体: 首先, 中间体P3A通过分子内巯基/二硫键交换反应形成过渡态中间体Ⅰ, 该中间体含有1个天然二硫键A6-A11和2个巯基分别位于A7和A20; 然后, 过渡态中间体Ⅰ的巯基和P4B或P6B上的巯基通过氧化反应(主要以折叠体系中的GSSG为氧化剂)分别形成含有2个天然二硫键的过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ; 最后, 过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ通过分子内巯基/二硫键交换反应形成第3个天然二硫键, 完成胰岛素体外折叠.     

人肌和兔肌肌酸激酶在低pH条件下再折叠的研究

利用蛋白质内源荧光和远紫外ＣＤ光谱研究了在低ｐＨ条件下人肌肌酸激酶和兔肌肌酸激酶的构象状态。结果表明,在低离子强度下,随着酸的加入人肌和兔肌肌酸激酶去折叠,至ｐＨ２．０附近几乎都达到充分去折叠。它们的色氨酸荧光发射峰位红移至３５０ｎｍ,这表明了内埋的色氨酸残基已经完全暴露到极性溶剂之中,它们的远紫外ＣＤ光谱表明二级结构也遭破坏,但是仍保留有相当部分的二级结构。而且在高离子强度低ｐＨ条件下由Ｇｏｔｏ等人首先发现的中间体构象状态（融球结构状态）在我们的实验中也被观察到了。它具有与天然酶类似的二级结构。色氨酸荧光发射光谱表明与天然酶类似,它的最大发射峰位也为３３５ｎｍ表明了蛋白质已经完全折叠,然而其荧光强度远低于天然酶,表明这种结构状态具有较大运动性而导致荧光的动态淬灭。上述结果支持了Ｇｏｔｏ等人的发现,说明了融球中间体结构可能是蛋白质折叠过程需经历的一个中间态。     

蛋白质折叠速率与其氨基酸序列极性的关系

以大肠杆菌60个蛋白酶以及几种常见病毒（SARS病毒、艾滋病病毒、丙型肝炎病毒及乙型肝炎病毒）各蛋白质序列中的所有α-螺旋和β-折叠片段为研究对象,计算了各片段的折叠速率和平均极性,分别在各物种的α-螺旋和β-折叠两类二级结构片段中分析了二者的相关性。得到结论：不论是大肠杆菌中的蛋白酶还是病毒蛋白,其中的两类氨基酸片段的平均极性与折叠速率都是极显著相关的：对于所有的α片段,二者呈线性正相关,而对于所有的β片段,二者成线性负相关。结果证实了在蛋白质折叠中,氨基酸的极性起着重要的作用。     

重组白细胞介素2体外折叠的实验研究

包涵体中的重组蛋白贩提后可以在变性状态下纯化,而纯化后的体外折叠（即复性）是基因工程下处理中的重要环节。荧光光谱研究表明,ＩＬ－２分子折叠过程中荧光强度逐渐减小,最大发射峰由３１６ｎｍ红移到３４８ｎｍ。以Ｔｒｐ残基的暴露程序反映分子的折叠状态,ＧＭ－ＣＳＦ在折叠过程中的荧光强度有类似变化,凝胶排阻ＨＰＬＣ可以检测折叠过程中的聚合体,而反相ＨＰＬＣ可以将ＩＬ－２分成三个相互独立的异构体色谱峰,据此可     

磷酸丙糖异构酶的折叠及稳定性研究

从鸡胸肌中纯化出磷酸丙糖异构酶(triosephosphateisomerase,TIM),通过蛋白质内源荧光,圆二色性,紫外吸收二阶导数光谱等多种研究溶液构象的方法,对TIM被盐酸胍和热变性过程进行了详细的研究.结果表明,用不同测量方法得到TIM的变性过程均高度协同,没有观察到折叠中间态,应用单分子二态去折叠模型计算了TIM去折叠的热力学参数.通过圆二色光谱在222nm处的变化监测的TIM热变性过程也是高度协同的二态过程,天然态TIM的表观Tm为64.6℃.在低浓度盐酸胍存在下,TIM的热稳定性降低.讨论了二体蛋白质的可能去折叠机制,证明在使用的实验条件下磷酸丙糖异构酶去折叠过程中二级结构与三级结构的变化是同时发生的,其去折叠遵循观察不到二体解离的表观二态过程.     

蛋白质的氧化重折叠

经过近几十年来广泛而深入的研究,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。1在已研究过的蛋白质中,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠,这与折叠能量景观学说是一致的。2正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）折叠中所起的重要作用并非相互排斥,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需,与控制肽链折叠无直接关系。3根据对BPTI的研究,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成,更具有普遍意义。4在氧化重折叠的早期,二硫键的形成基本上是一个随机过程,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述,在折叠的后期,二硫键的形成决定于折叠中间体的构象,类天然、有柔性的结构有利于天然二硫键形成和正确折叠,具有这类结构的分子为有效的折叠中间体,最终都能转变为天然产物;而无效折叠中间体往往具有稳定的结构,使巯基、二硫键内埋妨碍二硫键重排,并因能垒的障碍不利于进一步折叠。因此,降低无效折叠中间体的稳定性使之转变为有效折叠中间体是提高含二硫键蛋白质复性率的一条基本原则,实验证明,碱性pH、低温、降低蛋白质稳定性的试剂、蛋白质二硫键异构酶、改变蛋白质一级结构是实现这一原则的有效手段。此外,这里还就氧化重折叠的基础和应用研究的前景进行了讨论。     

光合作用系统II外周蛋白——P23k去折叠的热力学和动力学

利用荧光光谱学等方法结合高压力技术研究了光合作用系统II中的一个外周蛋白——— 2 3kD(以P2 3k表示 )蛋白的去折叠。热力学研究表明 ,在 2 0℃、180MPa(1MPa =10 .0大气压 )可使该蛋白质完全去折叠 ,而在3℃ ,16 0MPa即可使该蛋白质完全去折叠 ,这是迄今为止有关研究中最易被高压力去折叠的一个蛋白质。在2 0℃ ,该蛋白质在常压下去折叠反应的标准自由能与标准体积变化分别为 2 3.4 5kJ mol和 - 15 0 .3ml mol;动力学研究揭示该蛋白质的折叠反应的活化体积ΔV f 为正值 (84 .1ml mol) ,而去折叠反应的活化体积ΔV u 为负值(- 6 6 .2ml mol)。在常压下 ,折叠和去折叠反应的速度常数 (K0f,K0u)分别为 1.87s- 1 和 1.3× 10 - 4s- 1 ,这些结果为解释该蛋白质易被压力去折叠提供了线索     

SCOP数据库蛋白质折叠类型的自动分类分析

蛋白质折叠规律研究是生命科学领域重要的前沿课题之一,蛋白质折叠类型分类是折叠规律研究的基础。本研究以SCOP数据库的蛋白质折叠类型分类为基础、以Astral SCOPe 2.05数据库中相似性小于40%的α、β、α+β及α/β类所属的折叠类型为研究对象,完成了989种蛋白质折叠类型的模板构建并形成模板数据库;基于折叠类型设计模板建立了蛋白质折叠类型分类方法,实现了SCOP数据库蛋白质折叠类型的自动化分类。家族模板自洽性检验与独立性检验所得的敏感性、特异性以及MCC的平均值分别为:95.00%、99.99%、0.94与90.00%、99.97%、0.92,折叠类型模板自洽性检验与独立性检验所得的敏感性、特异性以及MCC的平均值分别为:93.71%、99.97%、0.91与86.00%、99.93%、0.87。结果表明:模板设计合理,可有效用于对已知结构的蛋白质进行分类。     

荧光研究表明去辅基天青蛋白突变体M121L至少存在两种不同的构象

以往对绿脓杆菌去辅基天青蛋白变性机制的研究认为它经历了一个复杂的反应过程,相比之下,锌离子替代的天青蛋白的变性符合简单的二态模型。以脲为变性剂对去辅基天青蛋白突变体M121L的变性过程进行了研究。结果表明,虽然稳态条件下突变体的变性／复性符合二态模型,但其动力学过程复杂,并可用溶液中存在着两种可以相互转化的构象的变性／复性来解释。天然态N1去折叠的速度快,其重折叠的速度也快,N1的折叠机制可用存在着折叠途径上的快速折叠中间体模型来描述;天然态N2的去折叠速度慢,其重折叠主要是首先生成天然态N1,然后再缓慢地转化成N2。添加Zn^2 能够把两种构象整合成一种构象,相应地,Zn^2 替代的天青蛋白突变体的变性过程简化为单指数过程。对该突变体的研究加深了对天青蛋白去折叠机制的理解。     

α类蛋白质折叠类型自动化分类研究

蛋白质折叠类型识别是蛋白质结构研究的重要内容,折叠类型分类是折叠识别的基础。通过对ASTRAL-1.65数据库α类蛋白质所属折叠类型进行系统研究,建立蛋白质折叠类型模板数据库,提取反映折叠类型拓扑结构的模板特征参数,根据模板特征参数和TM-align结构比对结果,建立基于特征参数的打分函数Fdscore,并实现α类蛋白质折叠类型自动化分类。使用相同数据集样本,将Fdscore分类方法与TM-score分类方法对比,Fdscore分类方法的平均敏感性、平均特异性、MCC值分别为71.86%、99.49%、0.69,均高于TM-score分类方法相对应结果。上述结果表明该分类方法可用于α类蛋白质折叠类型的自动化分类。     

蛋白质序列的混合特征值对折叠速率的影响

鉴于蛋白质折叠速率预测对研究其蛋白质功能的重要性,许多的科研工作者都开始对影响蛋白质折叠速率的因素进行研究。各种预测参数和方法被提出。利用蛋白质编码序列的不同特征参数,不同的二级结构及不同的折叠类的蛋白质对折叠速率的不同影响,我们选取蛋白质编码序列的新的特征值,即选取蛋白质序列的LZ复杂度,等电点等特征值。然后把这些特征值与20种氨基酸的属性αc、Cα、K0、Pβ、Ra、ΔASA、PI、ΔGhD、Nm、LZ、Mu、El融合,建立多元线性回归模型,并利用回归模型计算了13个全α类蛋白质、18个全β类蛋白质、13个混合类蛋白质和39个未分类蛋白质的ln（kf）与预测值之间的相关系数分别达到0.89、0.93、0.98、0.86。在Jack-knife方法的验证下发现在不同的结构中混合特征值与相应折叠速率有很好的相关性。结果表明,在蛋白质折叠过程中,蛋白质序列的LZ复杂度、等电点等特征值可能影响蛋白质的折叠速率及其结构。     

模拟蛋白质折叠过程的新算法研究

蛋白质折叠过程模拟是当前蛋白质研究领域的一个难点问题。针对这一问题,提出了一个描述蛋白质折叠过程的算法-拟蛇算法,并且从分子振荡和分子动力学理论两个方面来证明该算法的核心函数是可行和正确的。经过实验总结出所有蛋白质空间结构都可以通过两种类型函数构造出来,提出了描述蛋白质折叠过程模型。与其它蛋白质折叠过程模拟算法的实验结果比较表明,拟蛇算法所构造的空间结构能量值最小、相似度最好。进而说明拟蛇算法和蛋白质折叠过程模型在描述蛋白质折叠过程方面具有明显优势。     

FT-Raman光谱研究金属硫蛋白的折叠过程

为探索金属硫蛋白（ ＭＴ） 的折叠过程,寻找含硫蛋白折叠的动力,采用调节溶液ｐＨ 值的方法,使ＭＴ 处于不同的折叠状态。 测定了在ｐＨ１ ．０ － ７ ．５ 时溶液的Ｒａｍａｎ 谱, 进而得出ＭＴ 结构的变化。实验数据表明,在ｐＨ＝ ４ 时蛋白质的二级结构出现了两个转折点,提示ＭＴ 折叠过程中有两个中间态存在。根据实验结果,对ＭＴ 主链折叠的动力进行了讨论。     

蛋白质工程和蛋白质折叠

蛋白质一级结构决定着高级结构。蛋白质肽链在适宜条件下会自动卷曲形成其相应的高级结构,即自动发生蛋白质折叠,其自动发生的原因和过程仍不十分清楚,但是随着蛋白质工程的日益兴起,这些与折叠有关的问题也愈显重要,就此已有文章进行过讨论[1,2]。反之,如把新兴的蛋白质工程手段(尤其是基因定点诱变技术)应用来研究这些折叠问题,必将推动蛋白质折叠的研究。本文将就蛋白质折叠与蛋白质工程相互影响的一些例子进行讨论。     

不同因素对人Ⅹ型磷脂酶A2 包涵体重折叠的影响

人 Ⅹ型磷脂酶 A2 在大肠杆菌中的表达产物完全以不溶的包涵体形式存在 . 用以前适用于人胰型 (IB 型 ) 磷脂酶 A2 的稀释重折叠方法,并不能使它有效重折叠 . 以初步纯化的包涵体为对象,发现溶液的温度、 pH 值和蛋白质浓度对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 体外重折叠有很大的影响 . 研究了一些小分子化合物对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 ,在高蛋白质浓度 (1 g/L) 下重折叠的影响,发现 1 mol/L 的 L- 精氨酸能提高其重折叠效率达 6 倍多 . L- 精氨酸的结构类似物 L- 瓜氨酸对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的重折叠有较弱的改善,而 L- 赖氨酸和 L- 精氨酸甲基酯则降低了 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的活性恢复 . 结果表明 , L- 精氨酸对蛋白质重折叠的帮助作用,可能是通过精氨酸与折叠中间物的结合产生的,精氨酸的胍基和羧基都是必需的,其侧链胍基以其特殊的带电方式阻遏了重折叠过程中的积聚和分子间二硫键形成的反应 .