胰岛素的体外折叠: 折叠中间体的鉴定 及其折叠途径

在单链胰岛素体外折叠研究的基础上, 研究了胰岛素的体外折叠过程. 在胰岛素的折叠过程中捕捉到6个主要的折叠中间体, 分别命名为P1A, P2B, P3A, P4B, P5B和P6B. 中间体的折叠实验证明6个中间体都能最终折叠成胰岛素. 在中间体的鉴定和分析以及推断的过渡态中间体形成和作用的基础上, 提出了胰岛素体外折叠的两步折叠途径. (ⅰ) 在折叠过程的早期, 完全还原的胰岛素, 即A链和B链各自形成中间体: 2个A链中间体(P1A和P3A), 4个B链中间体(P2B, P4B, P5B和P6B). (ⅱ) 在进一步的折叠过程中, 推断相继产生3个过渡态中间体: 首先, 中间体P3A通过分子内巯基/二硫键交换反应形成过渡态中间体Ⅰ, 该中间体含有1个天然二硫键A6-A11和2个巯基分别位于A7和A20; 然后, 过渡态中间体Ⅰ的巯基和P4B或P6B上的巯基通过氧化反应(主要以折叠体系中的GSSG为氧化剂)分别形成含有2个天然二硫键的过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ; 最后, 过渡态中间体Ⅱ和Ⅲ通过分子内巯基/二硫键交换反应形成第3个天然二硫键, 完成胰岛素体外折叠.     

A7—B7二硫键缺失对胰岛素原重折叠及结构的影响

为研究A7 B7二硫键在胰岛素原结构和折叠中的作用 ,构建了A7 B7二硫键缺失的胰岛素原突变体 ,研究了其与野生型胰岛素原在体外重折叠产率、自由巯基氧化速度、CD谱、受体及抗体结合活性 ,以及对胰蛋白酶酶切敏感性的差别。结果表明 ,A7 B7二硫键缺失可导致胰岛素原α 螺旋明显减少以及对胰蛋白酶的酶切敏感性显著增加 ,其对胰岛素原结构的影响主要导致了受体结合活性的大幅度降低。突变体在体外重折叠 1h后巯基氧化速率较野生型明显减慢 ,但其最终折叠产率与野生型相当。由此提出一个胰岛素原折叠的可能途径 ,即A链链内二硫键最先形成 ,然后是两对链间二硫键。且A2 0 B19二硫键比A7 B7二硫键很可能先形成 ,在折叠中更重要。     

重组单链胰岛素在含有巯基试剂的变性剂中的解折叠

重组单链胰岛素(PIP)含有3对二硫键。在含有巯基试剂的变性剂中,PIP产生二硫键交换从而形成一系列具有不同解折叠程度的二硫键异构体混合物。分别用高压液相色谱（HPLC）和圆二色性（CD）光谱分析了PIP在含有0．2mmol/L2－巯基乙醇的尿素和盐酸胍中的解中的解折叠程度。PIP二硫键异构体混合物通过胰蛋白酶酶解并用质谱测定酶解片段的分子量,证明PIP确实产生了二硫键交换。同时还分离纯化了PIP的一种主要非天然二硫键异构体并研究了它重新折叠成天然构象的情况。观察到PIP只有一种热力学稳定的二硫键配对方式,PIP的非天然二硫键异构体在巯基试剂存在的条件下可以高效转化为天然二硫键配对。还将PIP解折叠和再折叠的情况与胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及胰岛素做了比较：胰岛素和PIP只折叠成一种热力学稳定的三级结构,IGF－I却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体;胰岛素的双链重组需缓慢进行,而PIP却可以快速折叠。     

蛋白质的氧化重折叠

经过近几十年来广泛而深入的研究,蛋白质氧化重折叠的机制已得到相当详细的阐明。1在已研究过的蛋白质中,大多数蛋白质都是沿着多途径而非单一、特定的途径进行氧化重折叠,这与折叠能量景观学说是一致的。2正是氨基酸残基间的天然相互作用而不是非天然的相互作用控制蛋白质的折叠过程。这一结论与含非天然二硫键的折叠中间体在牛胰蛋白酶抑制剂（BPTI）折叠中所起的重要作用并非相互排斥,因为后者仅仅是进行链内二硫键重排的化学反应所必需,与控制肽链折叠无直接关系。3根据对BPTI的研究,二硫键曾被认为仅仅具有稳定蛋白质天然结构的作用,既不决定折叠途径也不决定其三维构象。这一观点不适用于其它蛋白质。对凝乳酶原的研究表明,天然二硫键的形成是恢复天然构象的前提。天然二硫键的形成与肽键的正确折叠相辅相成,更具有普遍意义。4在氧化重折叠的早期,二硫键的形成基本上是一个随机过程,随着肽链的折叠二硫键的形成越来越受折叠中间体构象的限制。提高重组蛋白质的复性产率是生物技术领域中的一个巨大的挑战。除了分子聚集外,在折叠过程中所形成的二硫键错配分子是导致低复性率的另一个主要原因。氧化重折叠机制的阐明为解决此问题提供了有益的启示。如上所述,在折叠的后期,二硫键的形成决定于折叠中间体的构象,类天然、有柔性的结构有利于天然二硫键形成和正确折叠,具有这类结构的分子为有效的折叠中间体,最终都能转变为天然产物;而无效折叠中间体往往具有稳定的结构,使巯基、二硫键内埋妨碍二硫键重排,并因能垒的障碍不利于进一步折叠。因此,降低无效折叠中间体的稳定性使之转变为有效折叠中间体是提高含二硫键蛋白质复性率的一条基本原则,实验证明,碱性pH、低温、降低蛋白质稳定性的试剂、蛋白质二硫键异构酶、改变蛋白质一级结构是实现这一原则的有效手段。此外,这里还就氧化重折叠的基础和应用研究的前景进行了讨论。     

类胰岛素生长因子-1的C结构域不影响胰岛素二硫键的热力学稳定性

胰岛素和类胰岛素生长因子-1(IGF-1)都属于胰岛素超家族,两者不但一级、三级结构有较高的同源性,而且生理功能也有少量交叉.然而两者的折叠行为却有很大的差别：胰岛素及其重组前体(PIP)只折叠成一种热力学稳定的二硫键配对,而IGF-1却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体.为了了解两者折叠行为差异的分子机制,制备了由胰岛素的A,B链和IGF-1的C结构域构成的单链杂交分子——[B10Glu]Ins/IGF-1(C),研究了该杂交分子二硫键的热力学稳定性以及它在含有少量巯基试剂的变性剂中的解折叠程度,同时还纯化了该杂交分子一种主要的非天然二硫键异构体,并研究了它的再折叠情况. 观察到IGF-1中C结构域的引入并未改变胰岛素分子的折叠热力学,但是影响了折叠的动力学过程.     

不同因素对人Ⅹ型磷脂酶A2 包涵体重折叠的影响

人 Ⅹ型磷脂酶 A2 在大肠杆菌中的表达产物完全以不溶的包涵体形式存在 . 用以前适用于人胰型 (IB 型 ) 磷脂酶 A2 的稀释重折叠方法,并不能使它有效重折叠 . 以初步纯化的包涵体为对象,发现溶液的温度、 pH 值和蛋白质浓度对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 体外重折叠有很大的影响 . 研究了一些小分子化合物对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 ,在高蛋白质浓度 (1 g/L) 下重折叠的影响,发现 1 mol/L 的 L- 精氨酸能提高其重折叠效率达 6 倍多 . L- 精氨酸的结构类似物 L- 瓜氨酸对 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的重折叠有较弱的改善,而 L- 赖氨酸和 L- 精氨酸甲基酯则降低了 Ⅹ 型磷脂酶 A2 的活性恢复 . 结果表明 , L- 精氨酸对蛋白质重折叠的帮助作用,可能是通过精氨酸与折叠中间物的结合产生的,精氨酸的胍基和羧基都是必需的,其侧链胍基以其特殊的带电方式阻遏了重折叠过程中的积聚和分子间二硫键形成的反应 .     

不同因素对人Ⅹ型磷脂酶A2包涵体重折叠的影响

人Ⅹ型磷脂酶A2 在大肠杆菌中的表达产物完全以不溶的包涵体形式存在. 用以前适用于人胰型(IB 型) 磷脂酶A2 的稀释重折叠方法,并不能使它有效重折叠. 以初步纯化的包涵体为对象,发现溶液的温度、pH 值和蛋白质浓度对Ⅹ型磷脂酶A2 体外重折叠有很大的影响. 研究了一些小分子化合物对Ⅹ型磷脂酶A2 ,在高蛋白质浓度(1 g/L)下重折叠的影响,发现1 mol/L 的L-精氨酸能提高其重折叠效率达6倍多. L-精氨酸的结构类似物L-瓜氨酸对Ⅹ型磷脂酶A2 的重折叠有较弱的改善,而L-赖氨酸和L-精氨酸甲基酯则降低了Ⅹ型磷脂酶A2 的活性恢复. 结果表明,L-精氨酸对蛋白质重折叠的帮助作用,可能是通过精氨酸与折叠中间物的结合产生的,精氨酸的胍基和羧基都是必需的,其侧链胍基以其特殊的带电方式阻遏了重折叠过程中的积聚和分子间二硫键形成的反应.     

二硫键异构酶的纯化及其对重组蛋白体外折叠的影响

自牛肝中纯化了蛋白二硫键异构酶(PDI),并对重组蛋白的酶促折叠过程进行了探讨．结果表明。在等摩尔PDl的催化作用下,可使1mg／ml的IIJ-2的正确折叠率提高到58%以上,比活性由4×10⁶u／mg增加到8．2×10⁶u／mg,PDl还能部分纠正二硫键错配的IL-2异构体成为正确折叠的lL-2和防止IL-2通过cys的链问交联形成聚合体。GM-CSF在PDl催化下也有类似的结果。PDl作用的关键是它所催化的琉基一二硫键的交换反应。     

芋螺毒素氧化折叠研究进展

芋螺毒素(conotoxin,CTX)是当今生物毒素研究的热点之一,已经成为研究药理学和神经科学的重要工具。因此,芋螺毒素如何在体内和体外进行氧化折叠形成天然构象,获得有生物活性的芋螺毒素,越来越为人们所关注。根据当前研究状况,概述了芋螺毒素氧化折叠的一般过程,并总结了二硫键、PDI(二硫键异构酶)、前体肽等在芋螺毒素氧化折叠中所发挥的作用。此外,还就芋螺毒素氧化重折叠的研究前景和方向进行了展望。     

纪念“结晶胰岛素全合成”50周年——后继工作之一:单、双链胰岛素的体外折叠

<正>在胰岛素合成中,在A链内和A、B链间的3对二硫键正确配对是合成成功的关键。结晶牛胰岛素合成成功之后,张友尚先生、朱尚权先生等人长期进行胰岛素结构功能研究,邹承鲁先生团队进行了蛋白质折叠研究,我们在酵母中成功表达了猪胰岛素前体(porcine insulin precursor,PIP)的基因,并建立了胰岛素蛋白质工程技术。在这些研究基础上,我们于21世纪初,开展了单、双链胰岛素的体外     

Cys146-Cys146分子间二硫键在人瘦素二聚化过程中起主导作用

在前期研究中,已发现人瘦素（leptin）在体外再折叠过程中会形成稳定的二聚体,但其二聚化机制尚不清楚. 本研究旨在分析瘦素二聚体的结构特性,并重点研究体外再折叠过程中瘦素二聚化的机制. 相较与瘦素单体,瘦素二聚体保留了约75％免疫活性及15％受体结合活性,同时显示出明显慢的天然电泳迁移率. 圆二色性分析显示,二聚体基本保留了单体α螺旋索结构特征. 还原性及非还原性凝胶电泳分析和自由巯基测定结果表明,瘦素二聚体是由一对分子间二硫键连接2个单体而成的.为了确定瘦素二聚化过程中起主导作用的分子间二硫键,利用PCR定点突变技术构建了C96S和C146S两个突变体瘦素. 通过分析C96S及C146S突变体瘦素的体外再折叠特性及过程,并与野生型瘦素相比较,揭示C96S瘦素的二聚体显示出与野生型瘦素二聚体相似的特性,而C146S瘦素不能形成结构稳定的二聚体. 以上研究结果表明,Cys146-Cys146分子间二硫键在人瘦素二聚化过程中起主导作用.     

还原型胰岛素A、B链相互作用的初步研究

本文报道在chance所用“一步法”重组胰岛素的类似条件下,还原型A、B链相互作用研究的初步结果。在pH10.6对S—磺酸型A及B链加入1.2倍SH/SSO_3—的二巯基苏糖醇,在一小时内A、B链与DTT的混合物较之单独的A、B链与DTT的混合物,紫外差光谱显示295、245nm负差峰,峰值随时间增大;园二色性测定观察到混合链的α螺旋含量比单独的A、B链有所增加。这表明在A、B链的巯基氧化生成二硫链前,还原型A、B链间的相互作用导致Tyr残基逐渐内埋,肽链构象的调整使有序二级结构增加。根据此时还原程度的测定,讨论了DTT与S—磺酸型A、B链作巯基交换的可能机制,过多的还原试剂易破坏已正确配对的二硫键,也妨碍肽链构象的调整。     

重组蛋白的体外再折叠

重组蛋白的再折叠是基因工程下游处理中非常重要的环节。本文在分析了蛋白体外折叠的机制后,指出了重组蛋白再折叠的一般策略,并综述了近年来的主要新方法,包括：分析伴侣介导的再折叠去污剂协助的再折叠,反向微团中的蛋白再折叠,折叠促进剂的添加以及再折地促进二硫键形成的方法 。     

[A6-Ala,A11-Ala]-人胰岛素突变体的构建及其生物活性

利用 PCR技术 ,将胰岛素原基因中 A6和 A1 1的 Cys序列突变成 Ala序列 ,以去除 A链的链内二硫键 .突变基因连接到质粒 p BV2 2 0 ,构建了表达质粒 p JG40 3,并且在大肠肝菌中得到表达 .经过 Sephadex G- 50层析可得到纯化的突变人胰岛素原 ( Mut- HPI- Ala) .纯化产物用胰蛋白酶和羧肽酶处理 ,并经 Resource Q阴离子交换柱层析可进一步获得纯化的突变人胰岛素 ( Mut- HI- Ala) .Native- PAGE分析表明 Mut- HI- Ala的结构松散 .Mut- HPI- Ala的放射免疫活性和胰岛素受体结合活性是非突变人胰岛素原 ( Met- HPI)的 4.6%和 2 .4% .Mut- HI- Ala的放射免疫活性和胰岛素受体结合活性是非突变人胰岛素 ( Met- HI)的 4.3%和 4.6% .实验结果表明 ,胰岛素 A链内的二硫键对胰岛素的生物活性起着重要的作用     

二硫键与蛋白质的结构

二硫键是肽链上2个半胱氨酸残基的巯基基团发生氧化反应形成的共价键．具有链内二硫键和链间二硫键2种形式。与氨基酸的氨基氮原子之间形成的稳定共价键不同．二硫键容易被还原而断裂,断裂后可再次氧化重新形成二硫键,因而是可以动态变化的化学键。二硫键是参与一级结构也是形成高级结构的重要化学键,对蛋白质折叠和高级结构的形成与维持十分重要。讨论了二硫键的形成和特征及其与蛋白质结构和功能之间的关系,并讨论了生物学教学中关于二硫键的一些疑问．     

胰岛素及其苄基衍生物在钠-氨系统中的还原及活力恢复

(1)应用三种不同的方法制得了胰岛素苄基衍生物。胰岛素如果用钠-氨还原再与氯化苄作用,可以得到不再有完整二硫键存在的充分苄基化的产物。(2)将胰岛素、S-磺酸型A及B链混合物或者胰岛素苄基衍生物,在钠-氨内还原,然后在稀碱溶液中重氧化,都可以使胰岛素活力再生。用胰岛素或S-B磺酸型A及B链混合物时,经过此处理则活力可以恢复5—10%。用胰岛素苄基衍生物时则一般活力恢复1—2%。(3)从充分苄基化了的胰岛素衍生物能恢复活力这一事实说明可以通过人工合成的A和B链最后合成胰岛素。(4)观察了A和B键混合物巯基氧化和活力再生的过程,并进行了讨论。     

AUT凝胶电泳在牛胰核糖核酸酶折叠研究中的应用

目的:牛胰核糖核酸酶是一种用于蛋白折叠研究的经典模式蛋白,在折叠研究过程中主要使用高效液相色谱用于分离检测不同阶段的蛋白折叠中间体。高效液相色谱具有自动化、分离效果好、样品可回收等优点,同时也存在检测通量较低、仪器设备较为昂贵等不足。AUT凝胶电泳简便、快捷、检测通量较高,本文尝试将其应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。方法:使用AUT凝胶电泳、酶活性检测、质谱对牛胰核糖核酸酶还原变性过程及产生的折叠中间体进行检测;通过高效液相色谱和质谱对折叠中间单体进行分离检测,并分别进行AUT凝胶电泳检测以解析各折叠中间单体在电泳中的条带位置;通过AUT凝胶电泳和酶切后质谱鉴定各折叠中间单体的二硫键配对方式。结果:AUT凝胶电泳可以有效区分不同条件下的牛胰核糖核酸酶还原变性过程,检测结果与酶活性、质谱结果相符,并可以很好地区分牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体。高效液相色谱将牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间体分离为13个色谱峰,并与AUT凝胶电泳中的11个条带位置进行匹配。确认牛胰核糖核酸酶还原变性过程折叠中间单体的二硫键配对方式,并与AUT凝胶电泳条带进行匹配,Cys58-Cys110和Cys26-Cys84构象熵减作用强于Cys40-Cys95和Cys65-Cys72。结论:AUT凝胶电泳适用于检测牛胰核糖核酸酶折叠中间体,可以与高效液相色谱、质谱等检测技术相互补充,共同应用于牛胰核糖核酸酶的折叠研究。     

光合作用系统II外周蛋白——P23k去折叠的热力学和动力学

利用荧光光谱学等方法结合高压力技术研究了光合作用系统II中的一个外周蛋白——— 2 3kD(以P2 3k表示 )蛋白的去折叠。热力学研究表明 ,在 2 0℃、180MPa(1MPa =10 .0大气压 )可使该蛋白质完全去折叠 ,而在3℃ ,16 0MPa即可使该蛋白质完全去折叠 ,这是迄今为止有关研究中最易被高压力去折叠的一个蛋白质。在2 0℃ ,该蛋白质在常压下去折叠反应的标准自由能与标准体积变化分别为 2 3.4 5kJ mol和 - 15 0 .3ml mol;动力学研究揭示该蛋白质的折叠反应的活化体积ΔV f 为正值 (84 .1ml mol) ,而去折叠反应的活化体积ΔV u 为负值(- 6 6 .2ml mol)。在常压下 ,折叠和去折叠反应的速度常数 (K0f,K0u)分别为 1.87s- 1 和 1.3× 10 - 4s- 1 ,这些结果为解释该蛋白质易被压力去折叠提供了线索     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A（Disulfide bond formation protein A,DsbA）是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys³⁰残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys³⁰残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。     

大肠杆菌二硫键形成蛋白A（DsbA）研究进展

二硫键形成蛋白A(DisulfidebondformationproteinA,DsbA)是存在于大肠杆菌周质胞腔内的一种参与新生蛋白质折叠过程中催化二硫键形成的折叠酶。综述了DsbA三维结构、进化过程、协助蛋白质体内外复性方面的研究进展。DsbA比硫氧还原蛋白具有更强的氧化性,其强氧化性来自于Cys30残基异常低的pKa值和不稳定的氧化型结构,通过定点突变的研究表明了Cys30残基是DsbA活性中心最关键的氨基酸残基之一。DsbA不论在体内与目标蛋白融合表达还是在体外以折叠酶形式添加,都能有效地催化蛋白质的折叠复性,同时DsbA还具有部分分子伴侣的活性。