一种改进的烟草多酚氧化酶Ⅱ纯化方法

目的:选择不同的分离、纯化步骤并比对分析,筛选出纯化烟草中多酚氧化酶(PPO)的优化组合方案。方法:采用分段盐析、DEAE-SepharoseFastflow和SephadexG-150柱层析纯化PPO,通过测定和比较酶活性筛选最佳条件。结果:确定了最佳盐析浓度(40%)和柱层析条件,SDS-PAGE、FPLC以及动力学常数的检测结果表明,纯化出的蛋白质相对分子质量为42000,Km为1.2mmol/L,得到了纯化91倍的烟草多酚氧化酶Ⅱ。结论:优化方案减少了有机溶剂分级沉淀、阳离子交换层析等步骤,使纯化过程大大缩短。     

治学严谨的科学家——邹承鲁教授

在邹先生八十寿辰来临之际 ,作为先生的学生衷心祝愿老人家健康长寿 !二十几年前我有幸从师于邹承鲁教授 ,专攻酶的结构与功能研究 ,毕业后回清华大学工作。先生严谨治学、献身科学的精神一直影响着我们这一代人。邹先生 1 945年毕业于西南联合大学化学系 ,清华大学是先生的母校 ,他对清华感情深厚 ,十分关注清华大学生物科学与技术系的建立与发展 ,并长期担任我系的顾问与兼职教授 ,曾多次来清华作学术报告 ,亲自指导相关研究工作 ,为清华生物系教师的培养与成长做出了贡献。清华大学生物科学与技术系的迅速成长凝聚着先生的心血与期望。邹…     

氨基酰化酶在LDS溶液中的失活与去折叠的比较研究

氨基酰化酶在阴离子去污剂十二烷基硫酸溶液中的失活与去折叠的研究结果表明,在低浓度的ＬＤＳ溶液中变性时,以荧光和紫外差吸收方法监测的酶分子构象尚未发生明显变化,而酶的活力已经大部分或几乎全部丧失。当ＬＤＳ浓度达１．６ｍｍｏｌ／Ｌ时,此时酶分子的构象变化才达到最大程度。在实验使用的ＬＤＳ的浓度范围内,用远紫外ＣＤ光谱监测的二级结构没有发生明显的变化。     

人肌肌酸激酶胍变性时的失活与构象变化的比较研究

应用二阶导数光谱、紫外差吸收光谱和荧光光谱等监测手段,研究了人肌肌酸激酶在盐酸胍溶液中的构象变化。二阶导数光谱结果表明,若以6M盐酸胍中肌酸激酶酪氨酸残基的暴露程度为100％,则天然酶酪氨酸残基的暴露程度只有2％。而紫外差吸收光谱和荧光光谱的变化与兔肌肌酸激酶的结果相似。比较不同胍浓度下人肌肌酸激酶的失活与构象变化,表明酶的失活先于构象变化。同时还测定了不同浓度胍溶液中人肌酶的失活与构象变化的速度常数。结果表明以几种方法测定的构象变化均为单相的一级过程,而酶的失活却呈现了由快慢两相组成的一级反应过程。比较同浓度胍溶液中的失活速度与构象变化速度,发现酶失活的快相反应速度常数比构象变化的速度常数大1—2个数量级,慢相速度常数与构象变化速度常数相近。上述结果进一步支持了酶的活性部位构象柔性的观点。     

锌离子对氨基酰化酶构象及其稳定性的影响

天然氨基酰化酶和脱谷氨基酰化酶无论在二级结构（用ＣＤ和ＦＴＩＲ监测）还是三级结构上（以荧光发射光谱监测）都有明显的差异,表明了脱锌后酶的有序度降低;当比较天然和脱锌氨基酸化酶对去圬剂的稳定性时,结果表明脱锌后酶的构象的稳定性明显降低．因此可以认为锌离子对维持酶分子活性部位的特定构象以及构象的稳定性具有重要的作用．     

蛋白质结构中卷曲螺旋的研究进展

卷曲螺旋 (coiledcoil)是存在于多种天然蛋白质中的结构模式 .近年来 ,通过对天然蛋白质中卷曲螺旋结构以及根据已有知识设计合成的卷曲螺旋结构的研究 ,已基本掌握了这类结构模式的特点 ,并将特异的卷曲螺旋结构应用于生化分析、工业、医药卫生等领域 .本文主要从天然蛋白质中卷曲螺旋的主要存在形式及其生物学功能、卷曲螺旋的主要结构特点、影响卷曲螺旋稳定性和结构特异性的因素、卷曲螺旋结构设计及其应用以及今后卷曲螺旋研究的主要发展方向等几个方面对近年来卷曲螺旋结构的研究进展情况进行了综述 .     

植物功能基因组研究中的基因敲除技术

综述了T-DNA插入突变和转座子插入突变等基因敲除技术的原理及其在植物功能基因组研究中的应用,并简要介绍了向国际有关机构索要或购买拟南芥插入突变体的方法.     

DREB1A类转录调控域中对转录激活功能起关键作用的氨基酸

从烟草品种k326中克隆到2个干旱应答元件结合蛋白类(DREB-Like)转录因子基因,命名为NtDREBI和NtDREB1A.序列分析发现,NtDREBI和NtDREB1A编码的蛋白质具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类特征.酵母单杂交结果显示,NtDREBI具有激活功能, 而NtDREB1A不能激活下游基因,但可以与DRE元件结合.将NtDREBI、NtDREB1A与其它AP2/EREBP类转录因子序列比对,发现在C末端第148位氨基酸有显著差别.采用定点突变方法进一步研究表明,DREB1A类转录因子的第148位氨基酸残基与其邻近氨基酸残基的相互作用对调控转录激活功能起关键作用.     

烟草DREBP转录因子结合DRE元件的关键氨基酸

从烟草品种本塞母氏中分离出2条DREB类转录因子基因,分别命名为NbDREB1和 NbDREB2.根据测序结果推导出的氨基酸序列分析显示,NbDREB1和NbDREB2都具有典型的AP2/EREBP转录因子家族EREBP亚族A类特征.酵母单杂交结果显示,它们都不具有激活功能.连接pGADT7反式激活载体形成融合基因表达结果显示,NbDREB1能与DRE顺式作用元件结合,NbDREB2则不能.比较NbDREB1和NbDREB2的AP2区,发现两者的第2和49位氨基酸残基不同.对NbDREB2的第2位氨基酸残基N点突变为Y,NbDREB2也显示出与DRE顺式元件结合的活性,表明烟草DREB转录因子的AP2区第2位氨基酸残基Y是识别及结合DRE顺式作用元件必需的氨基酸残基.     

PAR对氨基酰化酶不可逆抑制动力学研究

本文将邹氏的在酶的活性修饰剂存在下的底物反应动力学理论应用于氨基酰化酶被金属螯合剂PAR脱锌而失活的动力学研究。通过对不同浓度的PAR存在下底物反应过程和含有PAR的不同浓度的底物中酶促反应的分析,讨论了PAR对氨基酰化酶的脱锌机制。这一过程很可能按如下机制进行:首先,PAR与酶分子活性部位的锌结合,形成一复合物,这一步是较快的反应,然后发生一个可逆的构象变化,最后是不可逆的去锌步骤。锌的存在显然稳定了酶活性部位的构象,而这正是酶活性所必需的。