巴泰病毒单克隆抗体的制备及鉴定

巴泰病毒(Batai virus,BATV)是一种人兽共患病毒,近年在全球广泛流行。我国也有人和动物感染的相关报道,而目前对BATV的研究仅局限于分子检测和全基因测序,还没有关于BATV单克隆抗体的相关研究,但制备特异性强、活性好的单克隆抗体也是防控BATV的关键。为了制备BATV单克隆抗体,本研究利用纯化的BATV作为抗原免疫雌性BALB/c小鼠,制备鼠源单克隆抗体。通过免疫小鼠后断尾取血,间接ELISA测其血清效价后,将SP2/0细胞与小鼠的脾细胞融合。ELISA方法筛选阳性细胞株,并进行亚克隆后制备单抗腹水,并利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水。结果获得7株单克隆抗体,包括5株IgG型和2株IgM型。其中制备的3E2单克隆抗体效价最高为1∶32 000。经间接ELISA、间接免疫荧光和Western Blot检测表明,制备的3E2单抗具有较好的纯度、活性和特异性,为BATV快速检测方法的建立及致病机制研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒单克隆抗体制备及特征分析

目的:制备伪狂犬病病毒(PRV)单克隆抗体,为PVR防控奠定基础。方法:用PRV疫苗毒株Bartha-k61免疫小鼠,取免疫小鼠脾脏B淋巴细胞与SP2/0细胞融合,用酶联免疫吸附实验筛选阳性杂交瘤细胞并制备腹水,用病毒中和实验检测单克隆抗体(腹水)对PRV的中和作用。结果:通过细胞融合,共得到11株针对PRV的杂交瘤细胞。中和实验结果显示,无论是对于PRV弱毒株Bartha-k61还是强毒株AV25,2株杂交瘤细胞产生的腹水都表现为明显的中和效应;但2株单抗的中和能力不同,其中1株杂交瘤细胞腹水的中和效价为1∶16~1∶32,另1株的效价为1∶4。交叉反应显示,11株单克隆抗体中,2株与单纯性疱疹病毒存在明显的免疫反应,1株与猴B病毒的gD蛋白存在明显交叉反应。结论:制备了PRV的单克隆抗体,并获得了对PRV具有中和作用的单克隆抗体,以及能与其他疱疹病毒交叉反应的单克隆抗体。     

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)单克隆抗体制备及检测方法的建立

该文通过制备出特异性高的单克隆抗体,初步建立了双抗夹心ELISA定量测定CK-MB的方法,为CK-MB试剂和原料的国产化奠定重要的基础。以购入的CK-MB抗原为免疫原,对随机选取的5只6～8周龄Balb/c健康雌性小鼠进行免疫。采用有限稀释法、间接ELISA、捕获ELISA方法,最终筛选出了3株能够稳定分泌抗体的细胞株,分别命名为2F6、2H3和2H9,其分泌的单克隆抗体亚型均为IgG3,腹水效价分别为1:102000、1:51200和1:102000。采用亲和层析法对3株杂交瘤细胞产生的小鼠腹水进行纯化,分光光度计测定纯化后的单克隆抗体2H3、2F6、2H9的浓度分别为5 mg/mL、6 mg/mL、6 mg/mL, SDS-PAGE结果表明,成功纯化了小鼠腹水,能够清晰地观察到轻链和重链两条带。Western blot结果表明,单克隆抗体2F6、2H3和2H9均能特异性识别CK-MB蛋白。间接ELISA及捕获ELISA方法检测显示,单克隆抗体2H3只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2H9只与CK-MB及CK-BB发生捕获ELISA方法反应;单克隆抗体2F6只与CK-MB及CK-MM发生捕获ELISA方法反应。稳定性实验表明, 3株杂交瘤细胞都能稳定分泌抗CK-MB单克隆抗体。高质量单克隆抗体的获得,为建立CK-MB检测方法奠定了基础。     

人生长分化因子15单克隆抗体制备、鉴定及药用价值初探

目的:制备稳定分泌抗人生长分化因子15(GDF15)单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞系,并对其分泌的m Ab进行鉴定。方法:根据人GDF15氨基酸序列特征,设计合成了8条能够免疫产生GDF15特异性抗体的抗原多肽,与VLP载体偶联后,免疫雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术制备鼠源抗人GDF15的m Ab,用间接ELISA检测m Ab腹水效价。结果:获得针对7个抗原多肽的12株稳定分泌抗人GDF15的杂交瘤细胞系,腹水m Ab效价可达1×104~1×109。结论:获得了针对不同抗原多肽的抗人GDF15的特异性m Ab,为进一步研发以GDF15为靶点的单克隆抗体抗肿瘤药物奠定了基础。     

羟基磷灰石一步提纯鼠腹水单克隆抗体

<正>注射杂交瘤细胞于小鼠所产生的腹水,除含有杂交瘤产生的单克隆抗体外,还含有大量的杂蛋白,如白蛋白和转铁蛋白。对于基础研究和医药的许多应用来说,从腹水中分离出单克隆抗体是很需要的。一种理想的单克隆抗体提纯方法应当是简单、快速和经济的。并应能处理大量的腹水,以及能提纯IgG和IgM两种单克隆抗体。     

应用A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体

应用Protein A亲和层析法,从采集的小鼠腹水中纯化出了抗凝血因子Ⅶ单克隆抗体,用SDS-PAGE和ELISA法分别检测了纯化后单克隆抗体的纯度及效价,结果显示,电泳为两条带,分别为免疫球蛋白G(IgG)的重链和轻链,纯化后的单克隆抗体纯度达到电泳纯,应用间接ELISA法测定腹水效价为1×10-7左右,与未纯化前无差异。结果表明,应用A蛋白亲和层析法能够得到纯度较高的单克隆抗体,适用于高纯度单克隆抗体的制备。     

乙氧基磷酸酯类有机磷农药单克隆抗体的制备与鉴定

制备针对乙氧基磷酸酯类有机磷农药的单克隆抗体,以此为基础建立该类农药的快速免疫筛选检测方法．以二乙基磷酸乙酸为通用结构半抗原,分别使之与牛血清白蛋白和鸡卵清蛋白共价偶联,合成免疫原和包被原并对其进行结构鉴定．偶联成功后的免疫原用于免疫Balb/c小鼠．将免疫成功小鼠的脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选能稳定分泌抗乙氧基磷酸酯类有机磷农药单克隆抗体的杂交瘤细胞株．获得的小鼠腹水用辛酸-硫酸铵法纯化,所得纯化抗体以琼脂双扩散法鉴定其免疫球蛋白类型,间接竞争ELISA方法测定其对半抗原的灵敏度、特异性和亲和性．结果表明,该抗体分泌IgG1亚类的单克隆抗体,且与二乙基磷酸乙酸的亲和性较高(1.4×10⁷ L/mol),所得抗体对毒死蜱、对硫磷、丙溴磷、氧化乐果、除线磷、二嗪农、溴硫磷、辛硫磷、喹硫磷、三唑磷等农药有特异性反应．该检测技术可用于上述农药的快速定性或定量检测．     

番茄环斑病毒单克隆抗体的制备

以纯化的番茄环斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)为抗原,注射免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0进行融合,经多次细胞筛选及克隆化,获得3株(A8、B7和G9)可分泌抗ToRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并以之分别制备小鼠腹水单克隆抗体。经酶联免疫吸附试验检测表明,该3株杂交瘤细胞腹水抗体效价在10-5～10-6之间,且均具有与ToRSV反应的特异性。     

NT-proBNP特异性单克隆抗体的制备及鉴定

旨在制备并鉴定抗人NT-pro BNP特异性单克隆抗体。采用重组NT-pro BNP蛋白免疫Balb/c小鼠,取血清效价高的脾细胞与SP2/0细胞融合,经HAT筛选和有限稀释法亚克隆,获得阳性杂交瘤细胞株,用动物体内诱生法制备腹水,用正辛酸-硫酸铵沉淀法将抗体纯化,并测定抗体的亚类、效价、特异性及相对亲和力。结果表明,获得4株能稳定分泌抗人NT-pro BNP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1G12、1B2、3D5和2D11。抗体Ig亚类,1G12和1B2为Ig G2a型,2D11为Ig G1型,3D5为Ig G2b型;1G12,1B2和3D5的抗体效价达到106,而2D11的效价仅达104。特异性好,1G12、1B2、3D5和2D11四株抗体的亲和常数依次为9.32×1011、1.07×1012、2.31×1012和6.33×1010。成功制备了特异性抗人NT-pro BNP单克隆抗体。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。     

建兰花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

用建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,CymMV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得3株能稳定传代并分泌抗CymMV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞(2C6、5B7和12G9),分别制备它们的单抗腹水。其中5B7和12G92株单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10-6,3株单抗的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为κ链。利用单克隆抗体建立了抗原包被间接ELISA(ACP-ELISA)检测CymMV的方法。蝴蝶兰病叶作1∶10240倍稀释、提纯CymMV病毒浓度为4.87ng/mL(每孔的病毒绝对量为0.487ng)时,该方法仍能检测到病毒。利用ACP-ELISA方法检测了田间样品,发现CymMV在兰花上发病很普遍。     

芜菁花叶病毒单克隆抗体的制备及检测应用

先以芜菁花叶病毒（TuMV）免疫BAL B/C小鼠,然后取其脾细胞使之与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选、克隆,获得4株能稳定传代并分泌抗TuMV单克隆抗体（Mab）的杂交瘤细胞,并以之制备腹水单抗。4株单克隆抗体腹水ELISA效价在10-5～10-6之间,仅对TuMV起特异性反应。Western blot分析表明,4株单抗都能与TuMV 34kD的外壳蛋白亚基起特异反应。利用TuMV的多抗兔血清和单抗腹水建立了三抗体夹心ELISA检测TuMV的方法,检测病叶的灵敏度为1∶5120倍,检测提纯TuMV病毒绝对量为21.9 ng。利用三抗体夹心ELISA测定出7种作物上有TuMV侵染。      

抗麻痹性贝毒素GTX2,3单克隆抗体的制备及特性分析

制备抗麻痹性贝毒GTX2,3单克隆抗体。利用醛化法将GTX2,3与载体牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备完全抗原。免疫小鼠,取小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。GTX2,3与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联作为检测抗原,用间接ELISA法筛选阳性克隆株。将筛选的阳性细胞株制备腹水。获得三株稳定分泌抗GTX2,3单克隆抗体的杂交瘤细胞株F4、F10、G9。间接ELISA法检测F10细胞株腹水抗体效价为1.4×10^-5。半抗原GTX2,3与载体蛋白偶联后,作为免疫原,可制备高滴度的抗GTX2,3抗血清和单克隆抗体。该抗体对于藻毒素具有高特异性和高亲和力,可用于污染海产品的麻痹性贝毒的检测。     

抗重组人表皮生长因子单克隆抗体的制备及生物学特性鉴定

建立能稳定分泌特异性抗重组人表皮生长因子(rhEGF)单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,制备出高效价的 ,具有生物学活性的抗重组人表皮生长因子单克隆抗体 ,为EGF及其单克隆抗体在肿瘤生长调节中的作用研究 ,为肿瘤的诊断与治疗提供具有实用价值的研究工具。此外 ,为EGF的亲和层析纯化提供材料。以BALB/c小鼠脾细胞为饲养细胞 ,运用细胞杂交瘤技术制备 ,间接ELISA法筛选出能稳定分泌针对人表皮生长因子的单克隆抗体细胞株 ;对杂交瘤细胞进行染色体核型分析并以体内诱生法产生腹水以获得大量单克隆抗体 ,并采用HiTrapProteinAHP柱对其纯化…     

结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的:制备重组结核分枝杆菌ESAT-6抗原鼠单克隆抗体.方法:采用杂交瘤技术,获得了12株针对结核分枝杆菌ESAT-6抗原的鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株,对其中的5株进行了小鼠腹水的制备及相关鉴定.结果:5株单克隆抗体的腹水效价达到1:512 000～1:1 024 000,纯化后纯度高于90%,抗体亚类(型)均为IgGl...     

蚕豆萎蔫病毒单克隆抗体制备及检测应用

:用蚕豆萎蔫病毒(BBWV)免疫的BALB/C鼠脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞融合,经筛选克隆,获得6株能稳定传代并分泌抗BBWV单克隆抗体(Mab)的杂交瘤细胞株,单抗腹水ELISA滴度为1:320000～1:640000,各单抗抗体类型均为IgG1。6株单抗与BBWV不同分离物均有反应,而与其它植物病毒无交叉反应。经Westernblot印迹分析表明,此6株单克隆抗体均是针对BBWV447kD的外壳蛋白大亚基的特异性抗体。这是国内外首次报道获得BBWV单克隆抗体     

鸡髓样分化因子88的原核表达及单克隆抗体制备

目的:克隆、表达、纯化鸡髓样分化因子88(MyD88),制备其单克隆抗体。方法:从脾脏cDNA中扩增857bp的MyD88基因片段,插入pMAL-c5X表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE分析MBP(麦芽糖结合蛋白)-MyD88重组融合蛋白的表达,切胶纯化目的蛋白;免疫BALB/c小鼠,制备针对MyD88的单克隆抗体,Western印迹检测抗体特异性,制备腹水并进行抗体亚型鉴定和效价测定。结果:构建了鸡MyD88原核表达载体pMAL-MyD88,并在大肠杆菌中获得高表达,目的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在;建立了3株抗鸡MyD88单克隆抗体细胞株,制备了腹水,亚型分别为IgG1、IgG1和IgG2a,轻链均为κ,腹水抗体的效价均为1∶2×105。结论:在原核表达系统中表达、纯化了重组鸡MyD88,制备了针对鸡MyD88的单克隆抗体,为后续的MyD88定量和功能研究奠定了基础。     

马铃薯卷叶病毒单克隆抗体的制备

采用杂交瘤技术,以马铃薯卷叶病毒(Potato Leafroll Virns,PLRV)为抗原,用直接将病毒注入脾脏和随后尾静脉注射的方法,免疫BALB/C小鼠。将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。用Dot-ELISA和间接血凝试验筛选分泌抗马铃薯卷叶病毒抗体的阳性克隆,建立了分泌抗PLRV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。用微量玻片双扩散法测定单克隆抗体亚类为IgG_1和IgG2a,轻链为λ。注射杂交瘤细胞株A_1、A_3、C_3和D_3于小鼠腹腔,制备出含高效价单克隆抗体的腹水。用获得的四种单克隆抗体对马铃薯卷叶病毒15个分离物进行了鉴定。     

抗人B7-H1单克隆抗体的制备和鉴定

目的:采用杂交瘤技术制备抗人B7-H1单克隆抗体,并对其进行鉴定。方法:经抗原免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞以常规方法融合;用间接ELISA法筛选分泌抗体的杂交瘤细胞株;阳性克隆用有限稀释法获得稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株;扩增杂交瘤细胞注射进小鼠腹腔后制备腹水;纯化腹水中的单克隆抗体并对其亚型进行鉴定;用间接ELISA法测抗体效价;将肺癌组织制成石蜡切片,用抗人B7-H1抗体进行免疫组化染色。结果:获得1株稳定分泌抗人B7-H1单克隆抗体的杂交瘤细胞株,所分泌的单抗类型为IgG1;抗体效价为1×108,纯化后的抗体含量为6.76g/L;免疫组化实验中,单抗可与肺癌组织表面的B7-H1蛋白特异地结合。结论:制备了人B7-H1单克隆抗体,为B7-H1检测试剂盒的研制奠定了基础。     

长叶车前花叶病毒上海分离株单克隆抗体的制备及其免疫学特性——Ⅰ单克隆抗体制备、亚类测定及免疫沉淀反应

采用杂交瘤技术,以长叶车前花叶病毒上海分离株(RMVsh)为扎原免疫BALB/c小鼠,取脾脏细胞与骨髓瘤SP2/O细胞融合,经筛选克隆,共获得1H2、7H1、10H1、11H2、12H3、17H6、29H17株分泌RMVsh单克隆抗体的杂交瘤细胞株。以双抗夹心ELISA方法测定亚类;1H2属IgG_3,7H1属IgG_(2b),其余均为IgC_1。7个杂交瘤植入鼠体内均产生腹水。在免疫双扩散反应中1H2、12H3能与RMVsh产生免疫沉淀线,而其余5个单克隆抗体均不能与RMVsh产生沉淀线。制备的单克隆抗体可用于病毒病害的诊断鉴定,也可用于进一步分析病毒的抗原特性。