巨大芽孢杆菌的青霉素酰化酶基因在大肠杆菌中的克隆 …

从巨大芽孢杆菌ＣＡ４０９８的基因组中,通过ＰＣＲ方法扩增青霉素酰化酶（ｐｇａ）基因,克隆到ｐＫＫ２２３－３质粒中,在Ｅ．ｃｏｌｉＨＢ１０１中得到表达。同时,测定了ｐｇａ基因的全部序列,推出氨基酸序列,再与不同菌种来源的青霉素酰化酶的氨基酸序列进行比较,表明它们的序列有一定的保守性,尤其是活性部位的保守性更强。     

东亚钳蝎神经毒素在大肠杆菌中的表达

以山西风陵渡东亚钳蝎（ＢｕｔｈｕｓｍａｒｔｅｎｓｉＫａｒｓｃｈ）的尾腺总ＲＮＡ为模板,根据已知的蝎神经毒素保守氨基酸序列设计引物,利用ＰＣＲ技术,扩增并克隆了两个蝎神经毒素基因．序列分析表明,由两个基因导出的氨基酸序列（ＢｍＫＭｍ１和ＢｍＫＭｍ２）与已知的蝎神经毒素ＢｍＫⅠ、ＢｍＫⅡ、ＢｍＫⅢ、ＢｍＫＭ１、ＢｍＫＭ９有很高的同源性．将ＢｍＫＭｍ２基因重组到大肠杆菌分泌型表达载体ｐＥｘＳｅｃ１中进行表达．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ证明表达产物被分泌到细胞周间质及培养液中．经ＩｇＧ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ纯化后的蛋白质注射小白鼠表明表达产物有生物学活性     

假单胞菌sp.130 GL-7-ACA酰化酶的核苷酸和蛋白质序列分析

对来源于假单胞菌sp.130的戊二酰-7-氨基头孢烷酸（GL－7－ACA）酰化酶结构基因的全序列及所编码蛋白质的α,β亚基的N末端和C末端的氨基酸序列进行了测定。将蛋白质序列与其他同类的GL－7－ACA酰化酶进行了同源性比较,结果显示该酶与来源于假单胞菌GK16和C427的酰化酶的序列有较高同源性,而与其它同类酰化酶的同源性较低。这些酶的α亚基N－末端差别较大,但是β－亚基的N－末端有较高的保守性。     

大肠杆菌青霉素G酰化酶基因及其邻近区域的核苷酸全序列

我们由E.coli AS1.76克隆了青霉素G酰化酶的基因,并且测定了其全部核苷酸序列。青霉素G酰化酶结构基因是由下述功能片段组成的:(1)编码信号肽(26个氨基酸残基)的78个碱基对;(2)编码α-亚基(209个氨基酸残基)的627个碱基对;(3)编码间隔肽(54个氨基酸残基)的162个碱基对;(4)编码β亚基(557个氨基酸残基)的1671个碱基对。此外,我们还发现起始密码子(ATG)前有个核糖体结合位点和启动子序列以及在终止密码子(TAA)之后有个转录终止信号。与最近发表的青霉素G酰化酶基因的DNA序列比较,同源性达99.7%。     

谷子核酮糖1,5—二磷酸羧化加氧酶大亚基基因的核苷酸序列

谷子（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ）叶绿体ＤＮＡ 含有ｒｂｃＬ基因的３．０ ｋｂ Ｂｇｌ Ⅱ＋ ＸｂａⅠ酶切片段被克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （－ ）质粒载体上,并构建了该基因的限制性酶切图谱,测定了该基因的１９９０ ｂｐ 全序列。其中基因的编码区长１４３１ ｂｐ,共编码４７６ 个氨基酸,推测其分子量为５２６７９ Ｄ。其３８９ ｂｐ 的５′上游区含有类似于原核生物的－ １０ ｂｏｘ、－ ３５ ｂｏｘ 和ＳＤ序列。其１７０ ｂｐ ３′下游区含有３ 个茎环结构。对Ｃ４ 植物和Ｃ３ 植物中的ｒｂｃＬ基因序列进行比较,表明在编码区、启动区和３′下游区没有差别。由此认为Ｃ４ 植物中ｒｂｃＬ基因的细胞特异性表达与其序列无关     

EB病毒胸苷激酶基因的定向克隆

采用异硫氰酸胍（ＧｕＳＣＮ）和硅藻从Ｂ９５－８细胞中快速抽摸板ＤＮＡ。根据ＥＢ病毒（ＥＢＶ）Ｂ９５－８株ＤＮＡ全序列及编码ＥＢＶ胸苷激酶（ＴＫ）的开放读框ＢＸＬＦ１的结构,设计合成一对引物,并在引物的５′一端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点,用ＰＣＲ技术扩增出一含完整的ＥＢＶＴＫ基因的１．８４３ＫｂＤＮＡ片段,ＮｃｏＩ酶切分析鉴定,ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切ＰＣＲ产物和载体,使目的基因定向克隆至选     

两个东亚钳蝎抗哺乳动物神经毒素的cDNA序列

从我国山东东亚马氏钳蝎尾腺中分离纯化ｍＲＮＡ,经逆转录构建了ＢｍＫ蝎毒ｃＤＮＡ文库。利用ＰＣＲ扩增,筛选到两个抗哺乳动物毒素的ｃＤＮＡ基因,并测定了序列。这两个ｃＤＮＡ阅读框均为２５２ｂｐ组成,可翻译８４肽的毒素前体,包括Ｎ端１９个氨基酸组成的信号肽,６４个氨基酸残芭的成熟毒蛋白,以及Ｃ端一个额外的碱性氨基酸Ａｒｇ。其中由一ＣＤＮＡ所推导的氨基酸序列（ＢｍＫＭ１）一已知的天然毒素ＢｍＫ１蛋白序列完     

蚕豆叶绿体atpE基因的克隆,测序和表达

蚕豆叶绿体的ａｔｐＥ和ａｔｐＢ基因在叶绿体ＤＮＡ ＫｐｎＩ酶切的第九条（约４．０ｋｂ）片段上,此片段被克隆到载体ｐＵＣ１８中,构成重组质粒ｐＵＫ１。用玉米叶绿体ａｔｐＥ基因作探针对ｐＵＫ１的ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＩ等的酶切产物进行杂交,确定了蚕豆叶绿体的ａｔｐＥ在ＣｌａＩ酶切的约０．９ｋｂ的片段上。根据ｐＢｕｌｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）ＤＮＡ多聚接头Ｆ引物和Ｒ引物测序,得到ε亚基基因的完整核苷酸序列。     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大立方形多角体突变株的分子生物学研究

利用空斑技术,从既能形成多角体又含ＴＫ酶基因的苜蓿丫纹夜蛾重组核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫ中,纯化了一株形成大立方形多角体的病毒突变株ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫｍｔ５１３。用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅡ及ＫｐｎⅠ等限制性内切酶对它做了酶切分析,并克隆了多角体蛋白全基因及其侧翼部分的片段。对所克隆的部分全序列测定结果,发现在多角体蛋白基因读码框内只出现了一个碱基的突变,导致了第２５位的氨基酸密码子由ＧＧＴ变为ＧＡＴ,该位氨基酸由甘氨酸（Ｇｌｙ）变为天冬氨酸（Ａｓｐｑ）还利用ＰＣＲ技术扩增出突变了的多角体蛋白基因部分片段,并将它克隆入转移载体质粒ｐＥＶ５５,与不形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＨＢｓＤ４ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,结果产生同样的大立方形多角体病毒。     

信号肽疏水性的提高促进青霉素G酰化酶分泌

设计和合成了一段具有连续１０仆亮氨酸强疏水核心的信号肽（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ,ＡＳＰ）,由ＥｃｏＲＩ－ＫｐｎＩ位点融合到青霉素Ｇ酰化酶（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇａｃｙｌａｓｅ,ＰＡＣ）信号肽（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ,ＷＴＳＰ）的－４Ｐｒｏ位点,分别构建了ＰＡＣ表达质粒：ｐＫＫｐａｃ△ＳＰ,ｐＫＫｐａｃＷＴＳＰ,ｐＫＫｐａｃＡＳＰ,ｐＥＴｐａｃ     

烟草β—1,3—葡聚糖酶cDNA克隆,大肠杆菌表达及植物表达载体的 …

用０．１５％乙烯利诱导烟草幼苗后,提取叶片总ＲＮＡ,并通过反转录及多聚酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增出β－１,３－葡聚糖酶基因的ｃＤＮＡ。将其克隆至载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ后,完成了此基因的全序列分析。测序结果表明：所克隆的ｃＤＮＡ除第１００８位碱基与所报道的不同外,其它序列完全一致。为制备抗血清,构建了此基因的大肠杆菌表达载体,并在表达宿主菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙＳ中得到表达,进行了Ｗ     

定点突变提高青梅素G酰化酶的稳定性

以大肠杆菌青霉素Ｇ酰化酶的晶体结构为模板,用软件ＰＭＯＤＥＬＩＮＧ同源模建巨大芽孢杆菌青霉素Ｇ酰化酶的三维结构。在此基础上,将β亚基４２７位（突变Ａ）和４３０位（突变Ｂ）赖氨酸残基突变为丙氨酸,降低了该酶的等电点,增加了疏水性,从而提高其在酸性和有机溶剂环境中的稳定性。两个突变与亲本相比,比活力和Ｋｍ相近,最适ｐＨ减少了０．５个单位,突变Ｂ在ｐＨ５．２的溶液中的稳定性明显提高。突变Ａ和Ｂ在１５％和     

转BmK IT4基因烟草的抗虫性

用酶切方法从「ｐＢＳ－ＢｍＫ ＩＴ４质粒中获得ＢｍＫ ＩＴ４基因片段,并构建ＣａＭＶ ３５Ｓ启动子下的ＢｍＫ ＩＴ４基因表达质粒ｐＥ３－ＢｍＫ ＩＴ４,以根癌土壤杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｒｍｅｆａｃｉｅｎｓ（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）Ｃｏｎｎ）介导的叶盘法转化云烟（Ｎｉｃｏ－ｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）Ｋ３２６叶片,获得４５株抗卡那霉素的再生植株。用这些再生植株进行抗虫     

豌豆外源凝集素基因的克隆及序列分析

从豌豆幼叶分离基因组ＤＮＡ,设计特异引物,用聚合酶链式反应方法扩增出豌豆外源凝集素基因并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＥｃｏＲＶ位点。进一步亚克隆至ｐＵＣ１９。序列分析表明,克隆到的片段大小为８３２ｂｐ,包含了豌豆外源凝集素基因完整的编码序列。该基因无内含子,同报道的已知序列相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为９９．６％和９８．９％。     

用简并寡核苷酸探针筛选对虾白斑综合征病毒DNA多聚酸基因片段

根据一些病毒的ＤＮＡ多聚酶氨基酸序列中特有的保守序列ＶＹＧＤＴＤ设计的简并寡核苷酸,经地高辛标记后与对虾白斑综合征病毒基因库克隆杂交,筛选出一段长度为７０７ｂｐ的ＥｃｏＲＩ基因片段,该片段在一个开放阅读框内。并含ＤＮＡ多聚酶Ｂ家族特有的保守序列ＹＧＤＴＤＳ。经与基因库比较,其氨基酸序列与藻类ＤＮＡ病毒科（Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）的几株藻类病毒的ＤＮＡ多聚酶片段有部分相似,因此推测该核苷酸片     

稻胚凝集素基因的克隆,序列分析及表达

以水稻基因组ＤＮＡ为模板,以特异引物经聚合酶链式反应方法扩增出稻胚凝集素基因并克隆到Ｅ．ｃｏｌｉ质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）的ＳｍａⅠ位点。序列分析表明,克隆到的基因片段大小为７８１ｂｐ,没有内含子,编码１条长２２７个氨基酸、分子量约２３ｋＤ的肽链,其中Ｎ－端２８个氨基酸是信号肽。与报道的稻胚凝集素ｃＤＮＡ序列进行顺序同源性比较,发现它们之间有很高的同源性（９９．７４％）,其编码区第１６７     

马立克氏病病毒（MDV）814株B抗原基因的克隆及部分序列分析

提取感染鸡胚成纤维细胞ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４病毒ＤＮＡ为模板,根据ＲＢＩＢ株ｇＢ基因５′及３′两端核苷酸离列设计引物,利用ＰＣＲ技术扩增了我国ＭＤＶ－Ｉ弱毒株８１４ｇＢ基因（２．９ｋｂ）将扩增片段平末端克隆到载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中ＥｃｏＲＶ位点,经ＢａｍＨＩ,ＨｉｎｄＩＩＩ酶切鉴定得到不同插入方向的重组质粒。构建圹增片段的酶切图谱及部分序列分析证明与ＲＢＩＢ株ｇＢ基因无差异,显示了极高的     

病毒Ea株UL54基因的克隆与分析和控制

用国外病毒Ｋａ株ＵＩ54 基因核苷酸序列 ,由华中农大牧医学院方六荣等设计一对包含有ＵＬ54 基因完整编码区引物 ,以国内地方分离株Ｅａ株细胞感染物为模板 ,经ＰＣＲ扩增出大小约 1.1ｋｂ的特性带、再将纯化的扩增产物克隆到 ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔⅡＳＫ+中 ,酶分析证实后经双脱氧末端终止法进行全序列测定 ,结果表明Ｅａ株ＵＬ54 基因全长 10 86ｂｐ ,可编 36 1个氨基酸 ,且推断Ｃ -末端具有典型锌指结构域。将Ｂｌａｓｔ软件与Ｋａ株ＵＬ54 基因进行同源比较 ,发现Ｅａ株ＵＬ54 基因在核苷酸和氨基酸水平上均有多处突变 ,但无插入或缺…     

中国人白细胞介素-12 cDNA基因的克隆及序列分析与比较

为研究中国人ＩＬ－１２的基因特征,采用逆转录巢式聚合酶链反应（ＲＴ－ｎＰＣＲ）从中国人脐带血单核细胞中分别克隆了Ｐ３５、Ｐ４０两亚基ｃＤＮＡ基因,包括完整的前体蛋白编码序列,其中Ｐ３５ ｃＤＮＡ编码２１９个氨基酸的多肽,Ｐ４０ ｃＤＮＡ编码３２８个氨基酸的多肽,与国外序列（ＮＫＳＦ、ＣＬＭＦ）比较结果发现：所克隆序列Ｐ３５同ＮＫＳＦ相比,第４４ａａ密友子由ＧＴＣ（Ｖａｌ）→ＧＴＧ（Ｖａｌ）,但未改     

巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化

青霉素酰化酶（ＰＧＡ）在医药工业起着重要的作用,它能够水解青霉素Ｇ产生６－氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ）和苯乙酸,６－ＡＰＡ是半合成青霉素的关键中间体．该酶广泛存在于各种微生物中如真菌和细菌中．国际上对Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｖｉｓｃｏｓｕ...