用PCR扩增和克隆马立克氏病病毒糖蛋白D基因

用ＰＣＲ技术,从ＧＡ株马立克氏病病毒（ＭＤＶ）感染的成纤维细胞（ＧＥＦ）基因组ＤＮＡ中扩增出ＭＤＶ糖蛋白Ｄ（ｇＤ）抗原基因片段的约１３００ｂｐ编码序列,将该ｐｃＲ扩增的产物于ＥｃｏＲＩ和Ｋｐｎｌ位点克隆到ｐＵＣ１８质粒载体中,在以ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ（ｄｉｇ）标记的ｇＤＰＣＲ产物作为探针,进行原位杂交初步筛选到阳性重组质粒克隆,再根据酶切分析筛选到含ＭＤＶｇＤ基因的重组质粒ｐ１８ＭｇＤ。将ｐ１８ＭｇＤ质粒ＤＮＡ用ｄｉｇ标记后,在Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ中,该探针能识别ＭＤＶ基因组ＤＮＡ的ＢａｍＨＩ－Ａ克隆中的Ａ片段ＤＮＡ。酶切位点分析表明,该ｇＤ克隆也和已发表的ＭＤＶ的ＲＢＩＢ株ｇＤ一样,不含有ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＰｓｔⅠ、ＳｍａⅠ、ｐｖｕⅡ等酶切位点。证明该重组质粒是ＭＤＶｇＤ克隆。     

蓝舌病病毒Z1株VP7基因的克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ扩增我国蓝舌病毒Ｚ１株的ＶＰ７基因,直接将其克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ载体中,用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ分析经蓝／白斑筛选和ＰＣＲ鉴定的重组质粒,用ＤＩＧ标记克隆片段制成探针与病毒基因组进行Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交,证明插入片段为ＢＴＶ ＶＰ７基因特异性片段。采用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧终止法测定ｃＤＮＡ片段的核苷酸序列,将这一序列与国外已发表的９株蓝舌病毒及相关的环状病毒的ＶＰ７基因进行了比     

传染性法氏囊病病毒CJ－801bkf毒株VP2 cDNA基因结构的分析

以传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＮ）中国毒株ＣＪ－８０１ｂｋｆ的基因组Ａ片段ｄｓＲＭＡ为模板,经反向转录和ＰＣＲ扩增,克隆了保护性抗原ＶＰ２ｃＤＮＡ基因。经Ｓａｎｇｅｒ法测序,确定了ＶＰ２ｃＤＮＡ基因有１４８４个核苷酸,推测了ＶＰ２氨基酸的顺序,与已报导的６株ＩＢＤＶ毒株ＣｕＩ、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２－７３、ＳＴＣ和ＶａｒｉａｎｔＥ的ＶＰ２区做了比较,证明：克隆的ＣＪ－８０１ｂｋｆＶＰ２ｃＤＮＡ基因是全长的,含有正确的起始密码子ＡＴＧ;ＣＪ－８０１ｂｋｆ与毒株Ｃｕｌ和ｐＢＧ９８同源性最高;ＣＪ－８０１ｂｋｆＶＰ２高可变区内两个亲水区的氨基酸顺序与ＣｕＩ、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２－７３和ＳＴＣ完全相同;７肽区内第三个丝氨酸残基则变异为精氨酸。这些结果提示,中国ＣＪ－８０１ｂｋｆ毒株应属标准血清Ｉ型ＩＢＤＶ弱毒株。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆、序列分析及其DNA免疫的初步研究

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株ＱＤ免疫原Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了克隆、序列分析和ＤＮＡ免疫的初步研究。ＲＴＰＣＲ扩增ＱＤ毒株的Ｓ１基因,将其５′和３′端分别进行分子修饰后插入克隆载体ｐＵＣ１８的ＢａｍＨⅠ／ＨｉｎｄⅢ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的克隆;利用英国ＩＢＶ毒株Ｓ１全基因核酸探针与ＱＤ毒株Ｓ１基因的重组克隆质粒分子杂交后,采用ＨａｅⅢ,ＰｖｕⅡ和ＸｂａⅠ等限制酶对此流行毒株Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了酶切分析;在测定ＱＤ毒株Ｓ１基因５′端高变区核苷酸序列并以此与ＩＢＶＭ４１,Ｈ１２０,６／８２及Ｂｅａｕｄ等参考毒株序列对比分析的基础上,构建了ＱＤ株Ｓ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒,肌肉注射免疫小鼠后,鸡胚病毒中和试验的结果表明,ＩＢＶＳ１基因ＤＮＡ免疫表达质粒能诱导小鼠产生病毒特异的中和抗体,具有良好的免疫原性,初步显示基因疫苗在鸡传染性支气管炎防治上应用前景。     

鸡传染性支气管炎病毒中国流行株免疫原S1基因的分子克隆,序？…

对来源于我国华东地区的鸡传染性支气管炎病毒流行株ＱＤ免疫原Ｓ１基因ｃＤＮＡ进行了克隆,序列分析了和ＤＮＡ免疫的初步研究,ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＱＤ毒株的Ｓ１基因,将其５′和３′端分别进行了分子修饰后插入克隆载体ＰＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄⅢ位点,大肠杆菌中实现了目的基因的克隆,利用英国ＩＢＶ毒株Ｓ１全基因核酸探针与ＱＤ毒株Ｓ１基因的重组克隆质粒子分杂交后,采用ＨａｅⅢ,ＰｖｕⅡ和ＸｂａＩ等限制酶对此     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 弱毒株膜蛋白（ Ｍ） 和核衣壳（ Ｎ） 蛋白基因为模板,设计的一对含有 Ｅｃｏ Ｒ Ｉ 和 Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切位点的引物,通过 Ｒ Ｔ Ｐ Ｃ Ｒ 扩增出一约９００ ｂｐ 的 Ｍ Ｎ 基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐ Ｂ Ｖ２２０ ,构建成重组质粒ｐ Ｂ Ｖ Ｍ Ｎ,导入大肠杆菌 Ｄ Ｈ５α,经温敏诱导,成功地表达了 Ｍ Ｎ 基因。表达产物经 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 电泳和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 印迹分析,其分子量约３４ ｋ Ｄ,与兔抗 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ Ｖ 高免血清发生反应,经光密度扫描分析,表达产物量占菌体总蛋白的１２ ％ 。该研究为 Ｐ Ｒ Ｒ Ｓ 基因诊断抗原的研制奠定了基础     

EB病毒胸苷激酶基因的定向克隆

采用异硫氰酸胍（ＧｕＳＣＮ）和硅藻从Ｂ９５－８细胞中快速抽摸板ＤＮＡ。根据ＥＢ病毒（ＥＢＶ）Ｂ９５－８株ＤＮＡ全序列及编码ＥＢＶ胸苷激酶（ＴＫ）的开放读框ＢＸＬＦ１的结构,设计合成一对引物,并在引物的５′一端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＰｓｔＩ切点,用ＰＣＲ技术扩增出一含完整的ＥＢＶＴＫ基因的１．８４３ＫｂＤＮＡ片段,ＮｃｏＩ酶切分析鉴定,ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ双酶切ＰＣＲ产物和载体,使目的基因定向克隆至选     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中的 …

以ＰＲＲＳＶ弱毒株膜蛋白（Ｍ）和核衣壳（Ｎ）蛋白基因为模板,设计的一对含有ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点的引物,通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出一约９００ｂｐ的ＭＮ基因片段,将此基因片段成功克隆于高效表达载体ｐＢＶ２２０,构建成重南粒ｐＢＶＭＮ,导入大肠杆菌ＤＨ５α,经温敏诱导,成功地表达了ＭＮ基因。表达产物经ＳＤＳ＿ＰＡＧＥ电泳和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ印迹分析,其分子量约３４ｋＤ,与兔抗ＰＲＲＳＶ高兔血清     

犬细小病毒中国内蒙株VP2基因克隆及序列分析

从我国内蒙古地区流行的犬细小病毒病病犬的肠溶物中分离提纯犬细小病毒（ＣＰＶ）。提取病毒基因组ＤＮＡ,并以此ＤＮＡ为模板,采用人工合成的引物进行ＰＣＲ扩增,ＰＣＲ产物经ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ双酶切后,克隆于ｐＵＣ１９质粒的ＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ位点。重组质粒ｐＵＣＶＰ２经ＰＣＲ鉴定、限制酶切分析和序列分析,结果表明：获得了犬细小病毒内蒙株（ＣＰＶ－ＩＭ）ＶＰ２基因的全长克隆,ＶＰ２基因全长１７５５ｎｔ,     

用RT-PCR和RFLP对禽传染性支气管炎病毒中国分离株的分型

用ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了禽传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）标准毒株Ｍ４１、Ｈ５２、Ａ５９６８和国内分离株Ｄ４１、Ｆ、Ｇ的Ｓ１基因,对它们做ＲＦＬＰ分析,发现Ｄ４１、Ｆ株属于马萨诸塞血清型、Ｇ株为变异株。对用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＦＬＰ来区分ＩＢＶ的分型方法的应用理论和前景进行了论述。     

猴免疫缺陷病毒SIV核心蛋白基因在大肠杆菌中表达的研究

应用多聚酶链反应（ＰＣＲ）,直接从ＳＩＶ感染的猴艾滋病（ＳＡＩＤＳ）模型猴的外周血淋巴细胞总ＤＮＡ中扩增出７６７ｂｐ的ＳＩＶ核心蛋白Ｐ２７基因片段。扩增产物经ＥｃｏＲＩ及ＳａｌＩ双酶切后,克隆入相同酶切的表达质粒ｐＢＶ２２０中,获得含ＳＩＶ核心蛋白基因片段的重组质粒ｐＢＶＳＧ,并进行ＤＮＡ序列分析。用该重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ经筛选、增殖及４２℃温度诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明外源基因表达蛋白含量占菌体总蛋白１４．５％,Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实表达产物能被ＳＩＶＰ２７单克隆抗体及ＳＡＩＤＳ模型猴血清中特异性抗体识别。     

猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析及真核表达载体的构建

根据ＧｅｎＢａｎｋ中猪圆环病毒２型（ＰＣＶ－２）ＯＲＦ２基因序列,设计一　对引物,应用ＰＣＲ从疑患断奶仔猪多系统消耗综合症（ＰＭＷＳ）的死亡仔猪组织病料中扩增出ＯＲＦ　２全基因（７０２ｂｐ）。将此片段克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ　ｅａｓｙ载体,筛选获得重组质粒ｐＴＯＲＦ２,并对此质　粒中的插入序列进行了测序分析,结果表明本试验克隆的ＯＲＦ２与美国ＰＣＶ－２分离株ＡＦ２６４０３９　的核苷酸及氨基酸序列同源性均达到１００％,与其他ＰＣＶ－２毒株同源性分别为９２．３％～９８．　６％和　９２．３％～９６．６％。重组质粒ｐＴＯＲＦ２经　Ｂａｍ　Ｈ　Ｉ、Ｅｃｏ　Ｒ　Ｖ双酶切,回收ＯＲＦ２基因,转　移入真　核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２／ＨｙｇｒｏＢ的相应酶切位点之间,构建成重组质粒ｐＳｅｃＴａｇＯＲＦ２。此重组表　达载体的构建成功为进一步研究ＯＲＦ２编码蛋白的生物学活性及建立ＰＣＶ诊断试剂盒打下基础。     

鸡马立克氏病病毒B抗原片段在大肠杆菌中表达

鸡马立克氏病病毒ＢａｍＨＩ基因文库Ｉ３质粒中含有编码Ｂ抗原膜外Ｄｏｍａｉｎ的ＤＮＡ序列。经ＳｃａＩ和ＳｐｈＩ双酶酶解Ｉ３质粒,分离获得７６４ｂｐＤＮＡ片段,并克隆进Ｍ１３ｍｐ１９中。ＤＮＡ序列测定分析表明克隆片段为ＭＤＶ－Ｂ抗原基因的４９４－１２５８ｂｐ部分序列。进一步分离ＮｃｏＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ部分基因片（５３０ｂｐ）,克隆于ＰＬＰｒｏｍｏｔｅｒ控制下的含有修饰型ｃＩｔｓ８５７基因的表达载体中,     

鸡传染性法氏囊病病毒内蒙古毒株VP2基因的克隆和序列分析

以鸡传染性法氏囊病病毒内蒙古毒株（ＩＢＤＶ-ＮＭ）ｄｓＲＮＡ为模板,用ＲＴ-ＰＣＲ法扩增其主要寄主保护抗原ＶＰ２基因的全长ｃＤＮＡ,克隆于ｐＵＣ１９的ＸｂａＩ／ＫｐｎＩ位点,进行了全序列分析。序列比较发现ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株ＶＰ２基因与已报道的其它７个ＩＢＤＶＣＪ８０１ｂｋｆ、Ｃｕ１、ＰＢＧ９８、５２／７０、００２—７３、ＳＴＣ及ＶａｒｉａｎｔＥ毒株之间高度同源,其核苷酸序列的同源率为９１.６％～９６．２％,推测的氨基酸序列的同源率为９６.２％～９８．６％。ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株ＶＰ２高变异区的第一个亲水区氨基酸序列与ＣＪ８０１ｂｋｆ、Ｃｕ１、ＰＢＧ９８、５２／７０、ＳＴＣ、００２—７３比较,有一个氨基酸差异,第二个亲水区氨基酸序列与上述６个毒株完全相同。而与ＶａｒｉａｎｔＥ比较,两个亲水区内各有两个氨基酸差异。此外,ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株ＶＰ２具有强毒株所特有的７肽保守区：ＳＷＳＡＳＧＳ。这些结果表明,ＩＢＤＶ-ＮＭ毒株为标准血清Ⅰ型ＩＢＤＶ强毒株。     

苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)大立方形多角体突变株的分子生物学研究

利用空斑技术,从既能形成多角体又含ＴＫ酶基因的苜蓿丫纹夜蛾重组核型多角体病毒ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫ中,纯化了一株形成大立方形多角体的病毒突变株ＡｃＭＮＰＶ－ＴＫｍｔ５１３。用ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔⅠ、ＢｇｌⅡ及ＫｐｎⅠ等限制性内切酶对它做了酶切分析,并克隆了多角体蛋白全基因及其侧翼部分的片段。对所克隆的部分全序列测定结果,发现在多角体蛋白基因读码框内只出现了一个碱基的突变,导致了第２５位的氨基酸密码子由ＧＧＴ变为ＧＡＴ,该位氨基酸由甘氨酸（Ｇｌｙ）变为天冬氨酸（Ａｓｐｑ）还利用ＰＣＲ技术扩增出突变了的多角体蛋白基因部分片段,并将它克隆入转移载体质粒ｐＥＶ５５,与不形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＨＢｓＤ４ＤＮＡ共转染Ｓｆ９细胞,结果产生同样的大立方形多角体病毒。     

HBV套式PCR技术的建立及HBcAb血清的检测

本文实验设计了套式ＰＣＲ引物进行ＨＢＶＤＮＡ诊断。外引物限定ＨＢＶＣ基因的一个６１３ｂｐ片段,内引物限定其内－５０７ｂｐ的片段,扩增后产物被限制性内切酶图谱证明。该技术的特异性强,重复性好,灵敏性达到１－１０ｆｇ,对ＨＢＶ血清可做出明确诊断。应用这项技术,对４２例ＨＢｃＡｂ血清进行了检测,实验表明仅ＨＢｃＡｂ阳性血清同带ＨＢｓＡｇ的ＨＢｃＡｂ阳性血清一样,体内持续进行着大量ＨＢＶＤＡＮ复制。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的结构和功能分析

以苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ）的ｅｇｔ基因作探针,从家蚕核型多角体病毒镇江株（ＢｍＮＰＶ ＺＪ－８）基因组中克隆了ｅｇｔ基因及其旁侧序列,作了该片段的酶切图谱;测定了ＢｍＮＰＶ ＺＪ－８ｅｇｔ基因序列。与ＡｃＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因相比同源性为９５％;基因大小都为１５１８ｂｐ。利用ｅｇｔ基因旁侧序列构建了转移载体ｐＵＤｅｇｔ,以绿色荧色光蛋白基因（ＥＧＦＰ）作报告基因取代ｅｇｔ基因,构建     

表达强毒pp38决定簇的马立克病病毒疫苗毒CVI988点突变株的构建和特性

用鸡马立克病病毒（ＭＤＶ）强毒ＧＡ株的３８ｋＤ磷蛋白（ｐｐ３８）基因克隆ＤＮＡ转染Ｉ型弱毒疫苗ＣＡＩ９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ株ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞,再用能识别Ｉ型强毒ｐｐ３８的单克隆抗体Ｈ１９做免疫荧光试验,筛选到能在ｐｐ３８基因上表达强毒株特异性抗原决定簇的定向点突变弱毒株ＣＶＩ／ｒｐｐ３８。用＾３５Ｓ－蛋氨酸标记的细胞裂解物做免疫沉淀反应表明,单抗Ｈ１９不能识别天然ＣＶＩ９８８株ＭＤＶ中的     

用RT—PCR和RFLP对禽传染性支气管炎病毒中国分离株的分型

用ＲＴ－ＰＣＲ方法获取了禽传染性支气管病毒标准毒株Ｍ４１,Ｈ５２,Ａ５９６８和国内分离株Ｄ４１,Ｆ,Ｇ的Ｓ１基因,对它们做ＲＦＬＦ分析,发现Ｄ４１,Ｆ株属于马萨诸塞血清型,Ｇ株为变异株。对用ＲＴ－ＰＣＲ和ＲＦＬＰ来区分ＩＢＶ的分型方法的应用理论和前景进行了论述。     

汉滩病毒A9株M基因片段在重组痘苗病毒中的表达及鉴定

为发展国产化肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）病毒基因工程疫苗,选择了汉滩病毒Ａ９株Ｍ基因片段为目的基因,构建转染质粒ｐＪＳＢＡ９Ｍ。以携带Ｌａｃ基因的重组病毒为亲本,使表达载体ｐＪＳＢ－Ａ９Ｍ上的Ｍ片段与痘苗病毒内的Ｌａｃ基因重组,将Ｌａｃ置换成Ａ９Ｍ片段。用蓝白斑法筛选重组痘苗病毒,经ＰＣＲ扩增证实Ａ９Ｍ片段重组入痘苗病毒基因组内。重组痘苗病毒感染的Ｖｅｒｏ Ｅ６细胞,用抗糖蛋白单克隆抗体（ＨＣＯ２、