耐热碱性磷酸酶功能结构域的进一步定位

为了进一步精确定位耐热碱性磷酸酶 (TAP)的功能结构域和建立酶功能结构域定位的有效方法 ,在对TAP进行序列相容性比对及二级结构统计预测的基础上 ,以二级结构单元的完整性为依据对其功能结构域进行定位 .TAP的功能结构域在 35～ 4 76氨基酸之间 ,记为TAPN3 4C2 5(TAP的N端去掉 34个氨基酸而C端去掉 2 5个氨基酸 ) ,比盛小禹等定位的少 15个氨基酸 .克隆、表达实验结果证明了TAPN3 4C2 5的酶学活性 ,其最适反应温度为 72℃ ,比TAPND2 7(N端去除了 2 7个信号肽氨基酸的TAP)上升了 7℃ ,而最高耐受温度为 83℃ ,比TAPND2 7下降了 16℃ .实验结果表明 ,以二级结构预测结果进行酶功能结构域定位是一种更为精确的方法 .     

腾冲嗜热杆菌热稳定海藻糖磷酸化酶的基因表达与酶的分子生物学性质研究

分离克隆了腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)海藻糖磷酸化酶(TreP)的编码基因(treP), 该酶可催化以葡萄糖和α-1-磷酸葡萄糖为底物的海藻糖合成反应及其逆向的分解反应. 反向mRNA点杂交实验表明, 腾冲嗜热杆菌中treP基因在高盐胁迫条件下表达量增加, 而在海藻糖诱导条件下表达量降低. 将该基因导入不含TreP的大肠杆菌中进行诱导表达, SDS-PAGE表明, 异源表达的TreP分子量约为90 kD, 与预期值相同. 通过葡萄糖氧化酶法测定分解产物葡萄糖的产率表明: TreP催化海藻糖分解反应的最适温度是70℃, 最适pH值为7.0; 通过HPLC检测合成产物海藻糖的产率表明: TreP催化合成反应的最适温度为70℃, 最适pH值为6.0. 在最适反应条件下, 50 μg的TreP粗酶可催化25 mmol/L α-1-磷酸葡萄糖与葡萄糖在30 min合成11.6 mmol/L海藻糖; 而同量的酶在同样时间内仅能将250 mmol/L海藻糖分解生成1.5 mmol/L葡萄糖. 以上体内胁迫和诱导表达分析及体外酶学性质分析均证明该酶的主要功能是催化海藻糖的合成反应. 热稳定性实验表明, 该酶性质比较稳定, 在50℃下温育7 h还能保持77%以上的活性, 是一个有潜在工业用途的新的热稳定海藻糖合成酶.     

青霉菌m8产半纤维素酶条件及酶性质研究

半纤维素酶可用于造纸工业的生物制浆和废水处理。通过碳、氮源对产胞外半纤维素酶的影响确定了青霉菌m8的适宜培养基 ,即 4 .5 %麦草粉 ,0 .5 0 % (NH4 ) 2 SO4 ,0 .1%KH2 PO4 ,0 .0 5 %MgSO4 ·7H2 O ,0 .0 3%NaCl,0 .33%Tween80 ,0 .15 %CaCO3。在上述培养基中 ,2 8℃恒温振荡 (12 0r min)培养 4 - 6d ,半纤维素酶活力可达 80u ml左右。用DNS法研究了该酶的性质。结果表明 ,其最适pH值为 4 .5 ,最适反应温度为 5 5℃ ;表观Km值为 4 .6× 10 - 2 g L ;该酶的耐热性比较强 ,可被K+ 、Ca2 + 、Mg2 + 离子激活 ,而被Ag+ 、Fe3+ 和Cu2 + 离子抑制。     

浙江产蝮蛇Agkistrodon halys(Pallas)蛇毒磷酸二酯酶的酶学性质及其对大分子核酸的作用

1.以双对硝基苯磷酸钠为底物,测得蝮蛇毒磷酸二酯酶的最适pH在10左右,最适温度在60℃左右;酶在37℃和60℃的Km分别为5.65×10~(-4)M和7.97×10~(-4)M。 2.酶在pH5—10.5范围和50℃以下稳定。 3.钙离子和镁离子对酶活力有激活作用,但钡离子、镁离子、锌离子、二价铅离子、钴离子、二价和三价铁离子、锰离子、镍离子等都有不同程度地抑制作用。 4.除乙酸根离子外,碳酸根,硫酸根,乙二胺四乙酸根、磷酸根,钼酸根,酒石酸根,柠檬酸根,亚硝酸根,巴比妥酸根和硫代硫酸根等阴离子都有不同程度地抑制作用。 5.蝮蛇毒磷酸二酯酶能充分水解RNA和DNA但后者的水解速度比前者快许多。     

耐热碱性磷酸酯酶的功能结构域的定位

 为了确定耐热碱性磷酸酯酶 (TAPND2 7)发挥活性所必需的功能结构域 ,通过 PCR介导的诱变缺失 ,得到了 N端分别缺失 8、1 6、2 5个氨基酸的 3个缺失体 p TAPN8、p TAPN1 6和p TAPN2 5以及 C端分别缺失 1 0和 30个氨基酸的两个缺失体 p TAPC1 0和 p TAPC30 .经表达和活性测定 ,发现 p TAPN8和 TAPC1 0保持了较高的活性而其余 3个缺失体则失去酶活性 .据此 ,TAPND2 7的活性区域被定位在 8～ 465氨基酸之间 .在分离纯化的基础上测定了一些酶学性质 .发现 TAPN8和 TAPC1 0的比活没有大的改变 ,Tm 下降了 5.5℃ ;TAPN8的最适反应温度上升了1 0℃ .结果提示了 N端和 C端的这些氨基酸残基对热稳定性有一定的贡献 ,N端氨基酸残基还对酶的亲热性有贡献 .     

青霉菌m8产胞外木聚糖酶的纯化及其性质研究

青霉菌m8产胞外木聚糖酶的适合培养基 (g/L) :含麦草粉 4 0 ,(NH4) 2 SO44.5 ,KH2 PO41.0 ,MgSO4·7H2 O 0 .5 ,NaCl 0 .3,Tween80 3.0 ,CaCO3 1.0。培养物中该酶经过离子交换和分子筛层析两步处理 ,粗酶被浓缩了 31倍 ,比活力达 4 6 7,收率为 5 0 %。该酶的最适 pH值为 4 .5 ,最适反应温度为 5 5℃ ,可被K+ ,Ca2 + ,Mg2 + 离子激活 ,而被Ag+ ,Fe3 + 和Cu2 + 离子纯化 ,其Km值为 4 .8× 10 -2 g/L。     

壳聚糖固定化半纤维素酶的研究

从青霉菌m8提取出半纤维素酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上.0.5 g壳聚糖与4%的戊二醛结合固定2.5 mg蛋白质,酶活回收率为45.6%. 原酶的最适pH为4.6,固定化酶为pH 3.6.原酶的最适温度为55℃,固定化酶在60～75℃都具有较高活性.固定化酶的耐热性优于原酶. 以半纤维素为底物,固定化酶的表观K_m值略低于原酶,前者为5.0×10^－2 g/L,后者为3.58×10^－2 g/L.     

木聚糖酶XYNB分子中折叠股B1和B2间的疏水作用对酶热稳定性的影响

对来源于Streptomycesolivaceoviridis的高比活木聚糖酶XYNB进行同源建模,并结合嗜热木聚糖酶氮末端芳香族氨基酸疏水作用的结构分析,设计了XYNB的T11Y定点突变,观察XYNB分子中折叠股B1和B2的疏水作用对酶的热稳定性的影响。将突变酶XYNB′在毕赤酵母中表达,表达的XYNB′经纯化后与原酶XYNB(同样经毕赤酵母表达后纯化)进行酶学性质比较,结果表明,XYNB′的耐热性比XYNB有明显的提高,但最适温度与原酶一样为60℃。另外,XYNB′的最适pH、Km值及比活性均有一定的改变。实验证实了木聚糖酶XYNB的氮端芳香族氨基酸之间的疏水相互作用与其热稳定性相关,为进一步的结构与功能研究提供了优良的基因材料。     

长吻鮠碱性磷酸酶的动力学研究

采用生化手段,从长吻鮠(Leiocassis longirostris Günther)肝中提取出碱性磷酸酶(AKP).提纯倍数为62.08倍,比活为66.43单位/mg蛋白,提取酶液经PAGE和SDS-PAGE只呈现一条区带.该酶的最适pH为10.05,7.0>pH>11.0时不稳定;最适温度为40℃,;对热不很稳定;以磷酸苯二钠为底物其Km值为1.82×10-3mol/L.Mg2+为该酶的激活剂,L-Cys、KH2PO4、DFP、ME、EDTA-Na2为抑制剂.选用KH2PO4,和DFP作抑制类型的判断,结果表明,KH2PO4,属竞争性抑制剂,其抑制常数为2.41mmol/L,DFP为非竞争性抑制剂,抑制常数为1.01mmol/L.       

壳聚糖固定化木聚糖酶的研究

从青霉菌m8提取出木聚糖酶,将其固定在用戊二醛交联的壳聚糖载体上。1．0g壳聚糖与4％的二醛结合固定3．5mg蛋白,酶活回收率为46．6％。在酶的最适pH为4．6,固定化酶为pH3．8。原酶的最适温度为55℃,固定化酶在60－75℃都具有较高活性。固定化酶的耐热性优于原酶,固定化酶的表现Km值略低于原酶,前者为5．0×10－2g／L,后者为3．58×10－2g／L。     

信号肽去除的耐热碱性磷酸酯酶FD-TAP在大肠杆菌中的亚克隆和高表达

通过计算机辅助分析,发现在耐热碱性磷酸酯酶（简称ＦＤ－ＴＡＰ）的Ｎ端存在２６个氨基酸的信号肽序列。但一般信号肽切点并非是完全专一的,所以利用基因工程手段将ＦＤ－ＴＡＰ的Ｎ端分别缺失２４、２５、２６和２７个氨基酸,得到了Ｎ端分别缺失２４、２５、２６和２７个氨基酸的克隆子ｐＴＡＰＮＤ２４、ｐＴＡＰＮＤ２５、ｐＴＡＰＮＤ２６和ｐＴＡＰＮＤ２７。考虑到这样的无隆子其翻译起始区所形成的能量较低结构稳定的二组     

磷胁迫条件下落叶松幼苗对难溶性磷的利用

以ＡｌＰＯ４为Ｐ源在温室内采用砂培的方法,研究了落叶松（Ｌａｒｉｘ ｇｍｅｌｉｎｉ）２年生幼苗对难溶性Ｐ酸盐的利用状况。结果表明,落叶松幼苗可以利用一定数量的ＡｌＰＯ４。在供ＡｌＰＯ４不接种菌根菌时,落叶松幼苗吸收的Ｐ可达正常供Ｐ时的３５．１％和６４．９％。不同菌种对落叶松幼苗利用ＡｌＰＯ４的影响不同。接种点柄乳牛肝菌（Ｓｕｉｌｌｕｓ ｇｒａｎｕｌａｔｕｓ）时,落叶松幼苗对ＡｌＰＯ４的利用量高于不     

疏水吸附性载体上附加基团对天冬氨酸酶性质的影响

6-氨基己酸和四乙烯基五胺通过高碘酸氧化法分别引入到邻甲苯胺基琼脂珠(TA)衍生物上,得到CTA和ATA,天冬氨酸酶在pH5.5,0.1mol/L磷酸缓冲液中,0.5mol/L KCl存在下通过疏水吸附固定化在TA,CTA和ATA上。结果表明三种固定化酶活力回收均达90％以上,同TA-天冬氨酸酶相比,CTA-酶,ATA-酶的最适pH,pH稳定性等均有所改变,其中ATA-酶的热稳定性,使用稳定性增强,CTA-酶的稳定性降低。     

Thermostability improvement of maltogenic amylase MAUS149 by error prone PCR

The thermostability of maltogenic amylase from Bacillus sp. US149 (MAUS149) was improved by random mutagenesis using error prone PCR. The library constructed for the mutants obtained was subjected to screening, leading to the selection of a thermostable mutant enzyme named MA-A27. The latter was noted to contain four single mutations, namely D46V, P78L, V145A, and K548E. The half-life times recorded for MA-A27 at 50 °C and 55 °C were 70 min and 25 min, compared to 30 min and 13 min for the wild type, respectively. The results from molecular modeling attributed the increase in thermostability observed for MA-A27 to P78L and K548E substitutions that led to new hydrogen bond and salt bridge formations. Further site-directed mutagenesis studies showed that the P78L and K548E single mutations underwent an increase in thermostability, thus confirming the joint contribution of both substitutions to the increase in thermostability observed for MA-A27.     

重组水蛭素的突变及突变体部分性质研究

以基因突变结合动力学分析的方法研究了水蛭素空间结构及其与凝血酶的相互作用．采用基因定点突变和随机突变的方法得到两个重组水蛭素突变体,并从抗酰胺水解活性,抗凝血酶活力和稳定性三个方面,比较研究了重组水蛭素ｒＨＶ２中４７位和１１位两个氨基酸残基对其稳定性和抑制能力的影响．将ｒＨＶ２中Ｇｌｎ１１和Ａｓｎ４７分别突变为Ｈｉｓ１１和Ｌｙｓ４７后,ｒＨＶ２－Ｈ１１生物活力降低３０％,ｒＨＶ２－Ｋ４７生物活力提高６１％．测定抑制常数Ｋｉ表明,ｒＨＶ２－Ｈ１１突变体Ｋｉ值升高１４倍,ｒＨＶ２－Ｋ４７突变体Ｋｉ值降低１４倍,两个突变体的热稳定性均有所增强,ｒＨＶ２－Ｈ１１在酸性和碱性条件的稳定性降低．分析实验结果,可以认为：①４７位的Ｌｙｓ可能是通过氢键和静电两种作用力同时影响着水蛭素的三维结构和其与凝血酶的结合．②１１位氨基酸可能是水蛭素分子中另一个重要位点．     

温度和施磷对石灰性潮土小麦苗期生长及磷形态的影响

以石灰性潮土为对象,通过盆栽试验研究温度和磷肥对小麦苗期生长和土壤无机磷形态转化的影响.结果表明: 温度和磷肥是影响小麦生长的重要因子,但二者交互作用影响不显著.温度对小麦生长的影响大于施用磷肥,15 ℃是小麦苗期的适宜生长温度.与不施磷肥(-P)处理相比,5 ℃下,施磷肥(＋P)处理显著促进了小麦生长,小麦地上部、根部生物量分别提高18.2%、33.3%,地上部、根部磷素积累量分别提高30.6%、13.3%,根冠比、株高、分蘖、根系活力分别提高3.5%、10.0%、10.5%、70.3%;15 ℃下,施用磷肥对小麦生物量、分蘖影响不显著,但小麦地上部、根部磷素积累量分别提高32.3%、23.8%,根冠比、株高、根系活力分别提高15.6%、2.5%、32.8%;25 ℃下施用磷肥对小麦生长没有促进作用. 3种温度下,施磷能显著增加各处理土壤有效磷(Olsen-P)、二钙磷(Ca₂-P)、八钙磷(Ca₈-P)、铝磷(Al-P)和铁磷(Fe-P)含量.-P和+P处理下,温度对Ca₂-P含量影响不显著,对Olsen-P、Ca₈-P、Fe-P、Al-P含量影响显著.Ca₈-P、Fe-P含量表现为5 ℃>15 ℃>25 ℃;Al-P含量表现为25 ℃>15 ℃>5 ℃.小麦苗期可以吸收利用根际土壤Ca₂-P、Ca₈-P、Al-P、Fe-P,而Al-P、Fe-P对小麦的有效性明显低于Ca₂-P、Ca₈-P.各处理pH、闭蓄态磷(O-P)和十钙磷(Ca₁₀-P)差异不显著.总之,温度主要通过影响小麦生长来影响磷素吸收,低温下施用磷肥能显著促进小麦生长,高温能加速石灰性土壤有效磷的固定,施磷能缓解这一过程.     

菌根真菌磷酸酶活性对红三叶草生境中土壤有机磷亏缺的影响

利用PVC分室培养装置研究了菌根际和菌丝际磷酸酶活性变化与土壤有机磷亏缺间的关系,结果表明,施用有机磷（植酸钠）能促进菌根根系侵染、提高土壤磷酸酶尤其是酸性磷酸酶的活性,使菌丝际范围变宽。菌丝际的存在使土壤有机磷亏缺范围加大,与非菌根植物相比,由于菌根真菌的作用,植物能更容易地从有机磷中获得磷营养以满足植物生长的需要,从而使其干物重和磷吸收量更高。     

Kinetic analysis of [35S]dATP alpha S interaction with P2y(1) nucleotide receptor

The kinetics of 2'-deoxyadenosine-5'-O-(1-thiotriphosphate) ([(35)S]dATP alpha S) interaction with membrane fragments of transfected astrocytoma 1321N1 cells, expressing human P2Y(1) receptors, and the same wild-type cells, not expressing P2Y receptors were studied. Binding of this radioligand was observed with both types of membranes, but sites showing slow on-rate were found only on the transfected cells. These "slow" binding sites behaved as a kinetically homogeneous population and their interaction with the radioligand was shown to occur in two steps, R+A(K(A))<==>RA(k(i))<==>(k(-i))(RA), including the relatively slow isomerization of the complex RA into (RA). Evidence was obtained to assign the isomerized ("slow") binding sites on the transfected cells as P2Y(1) receptor sites, differentiated from other binding sites of non-receptor origin by kinetic analysis, and characterised by the kinetic parameters K(A)=59 +/- 19 nM, k(i)=(9.0 +/- 0.8)10(-3)s(-1) and k(-i)=(3.9 +/- 0.7)10(-3)s(-1). [(35)S]dATP alpha S binding, with kinetic criteria, can be of value for differentiation of the receptor sites from non-receptor sites and thus provides solid basis for radioligand assay of P2Y(1) receptors.