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1.
通过生物素与亲和素-酶复合物系统或地高辛与抗地高辛-酶复合物系统可把酶间接标记到探针上.Renz等通过不同的化学方法直接把酶标记到探针上[1~3].耐热性碱性磷酸酯酶FD-TAP(thermostablealkalinephosphatase)具有耐...  相似文献   
2.
通过计算机辅助分析,发现在耐热碱性磷酸酯酶(简称FD-TAP)的N端存在26个氨基酸的信号肽序列。但一般信号肽切点并非是完全专一的,所以利用基因工程手段将FD-TAP的N端分别缺失24、25、26和27个氨基酸,得到了N端分别缺失24、25、26和27个氨基酸的克隆子pTAPND24、pTAPND25、pTAPND26和pTAPND27。考虑到这样的无隆子其翻译起始区所形成的能量较低结构稳定的二组  相似文献   
3.
从58株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌,它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在95℃中保温60min后仍保留原来活力的75%.测定了酶的一系列性质,包括酶作用的最适pH、最适离子强度、最适温度,以及酶的热稳定性、米氏常数、活化能等等,还研究了一些无机离子、氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响.DNA杂交方面的初步实验结果表明用该酶标记的核酸作为非放射性探针可用于在高温下进行的杂交反应.  相似文献   
4.
 为研究体外磷酸根离子对嗜热菌 (Thermussp .30 4 1)碱性磷酸酶TAPND2 7耐热性的影响 ,通过克隆于高表达质粒上编码TAPND2 7的基因在E .coli中的诱导表达和蛋白产物的纯化 ,获得了电泳纯的TAPND2 7.耐热性实验表明磷酸根离子能显著提高该酶的热稳定性 ,在 10mmol L磷酸根离子存在下 ,TAPND2 7的Tm 值从 91℃上升到了 97℃ ;酶的动力学实验证实无机磷酸盐 (Pi)对TAP ND2 7的酶活性有可逆竞争性抑制作用 ,Ki 值为 0 99× 10 -4 mol L .上述结果说明 ,TAPND2 7耐热性的提高是由于磷酸根离子对TAPND2 7活性位点的竞争性结合 ,这种结合 ,推测为Pi 与氨基酸残基间的非共价相互作用 ,减小了TAPND2 7的自由能 ,从而提高了它的热稳定性  相似文献   
5.
耐热碱性磷酸酶(FD-TAP)的结构模型研究   总被引:4,自引:0,他引:4  
 以大肠杆菌碱性磷酸酶 (BAP)为主要结构模板 ,用计算机同源结构模拟方法构建了耐热碱性磷酸酶 (FD TAP)的三维结构 ,对它们的结构特征进行了分析比较 ,并用Profile 3D和Ramachand ran图等方法分析了结构的合理性 .在此基础上 ,又构建了FD TAP 3个突变体的结构 ,用CHARMM能量计算法研究了FD TAP及其 3个突变体的能量与酶蛋白热稳定性之间的关系 ,得到了与实验完全一致的结果 .结果说明 ,如果氨基酸残基置换使蛋白质分子的总能量降低 ,疏水性增高和柔韧性减小 ,往往使蛋白质的耐热性增加  相似文献   
6.
耐热碱性磷酸酯酶的功能结构域的定位   总被引:4,自引:2,他引:2  
 为了确定耐热碱性磷酸酯酶 (TAPND2 7)发挥活性所必需的功能结构域 ,通过 PCR介导的诱变缺失 ,得到了 N端分别缺失 8、1 6、2 5个氨基酸的 3个缺失体 p TAPN8、p TAPN1 6和p TAPN2 5以及 C端分别缺失 1 0和 30个氨基酸的两个缺失体 p TAPC1 0和 p TAPC30 .经表达和活性测定 ,发现 p TAPN8和 TAPC1 0保持了较高的活性而其余 3个缺失体则失去酶活性 .据此 ,TAPND2 7的活性区域被定位在 8~ 465氨基酸之间 .在分离纯化的基础上测定了一些酶学性质 .发现 TAPN8和 TAPC1 0的比活没有大的改变 ,Tm 下降了 5.5℃ ;TAPN8的最适反应温度上升了1 0℃ .结果提示了 N端和 C端的这些氨基酸残基对热稳定性有一定的贡献 ,N端氨基酸残基还对酶的亲热性有贡献 .  相似文献   
7.
季朝能  张冰  姜涛  盛小禹  毛裕民 《遗传学报》2000,27(12):1100-1107
通过对耐热碱性磷酸酯酶TAPND27活性位点S(69)两侧的E(68)和S(70)的定点突变,得到了3个突变子E68S、S70A和E68SS70A。在蛋白纯化的基础上测定了3个变体的一些酶学性质,与TAPND27相比,E68S的比活力上升8倍,Tm下降了3℃,最适反应温度上升了20℃;S70A的比活力上升了1部,Tm下降了2℃,最适反应温度上升了5℃;E68SS70A的比活力下降了50%,Tm下降  相似文献   
8.
为了进一步揭示蛋白质的耐热机制,对含有耐热碱性磷酸酯酶(FD-TAP)的表达质粒pTAP503F进行了随机诱变,用菌落原位显色法从约5000个转化子中筛选到4个耐热性下降的突变型克隆,并对其中1克隆(TAPM3)进行了部分酶学性质、DNA和氨基酸序列的研究。酶学性质研究表明,与野生型相比,该突变型酶的耐热性有较大幅度的下降,而热激活性无明显改变。DNA序列分析表明在1239位TAPM3发生G→A转  相似文献   
9.
嗜热细菌的碱性磷酸酯酶的研究   总被引:13,自引:0,他引:13  
从58株来自国内温泉的嗜热细菌中分离到一株菌,它所产生的耐热碱性磷酸酯酶在95℃中保温60min后仍保留原来活力的75%。测定了酶的一系列性质,包括酶作用的最适PH,最适离子强度,最适温度,以及酶的热稳定性,米氏常数,活化能等等,还研究了一些无机离子,氨基酸以及表面活性剂对酶活的影响。  相似文献   
10.
用PCR随机诱变方法,研究氨基酸置换对耐热邻苯二酚2,3-双加养酶性质的影响。比较分析了突变体ro229Ser和Glu243Gly与野生型酶的酶学性质。结果显示点突变Pro229→Ser或Glu243→Gly并未改变酶的最适反应温度(均为60℃);突变体Pro229Ser(Kcat/Km=4.89±0.01×10  相似文献   
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