G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL／neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg／ml的G418和300μg／ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

人乳头瘤病毒16型亚基因DNA体外转化功能的细胞学研究

利用HZIP16和HZIP16K(见材料和方法)质粒,将人乳头瘤病毒16型(HPV-16)的全早期区基因及其开放读码框架(ORF)E6-E7分别转入ψ2细胞,所产生的重组病毒能诱导NIH3T3细胞发生转化。转化细胞具有恶性细胞的生物学和形态学特征,可在0.3％软琼脂中形成集落,可使裸鼠致瘤。Southern blot证明,HPV-16 E6-E7 ORFs序列以整合形式存在于转化细胞和裸鼠肿瘤细胞DNA中,表明HPV-16 DNA具有体外诱导NIH3T3细胞恶性转化的作用,E6-E7 ORFs是诱导细胞转化的关键基因。     

γ射线诱发大鼠胚胎细胞转化与N－ras的激活

以γ射线诱发转化的大鼠胚胎细胞(REC:myc:γ33)的DNA构建粘粒基因库,用总基因库DNA转染NIH/3T3细胞,产生转化灶的DNA作二轮转染,二轮转化的NIH/3T3细胞内有大鼠REC:myc:γ33DNA中具转化活性的N-ras基因,用不对称PCR和DNA序列分析法证明,REC:myc:γ33细胞中鼠N-ras的活化是由于第61位密码子的A→G点突变.NIH/3T3转化灶中鼠N-ras也有同样点突变,但NIH/3T3细胞的内源性N-ras基因则无此突变.     

pcDNA3.1/myc-His-DJ-1^M26I重组载体构建及其对NIH3T3细胞增殖和凋亡研究

目的构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础。方法采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞（P〈0.05）。结论成功构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1 M26I的NIH3T3细胞。DJ-1 M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡。     

EcoRⅡ甲基化酶基因在小鼠NIH3T3细胞中的表达

CG外甲基化在哺乳动物细胞中的生物学意义仍不清楚。建立了特定位点CCWGG（W＝A／T）甲基化的哺乳动物细胞株。来自大肠杆菌的EcoRⅡ甲基化酶（催化CCWGG→CmCWGG）基因经定点诱变后重组到真核表达载体pCI－neo上,采用脂质体介导的方法将其转染小鼠NIH3T3细胞,经G418筛选获得有效表达的细胞株,酶切证实该细胞株基因组DNA上的大部分EcoRⅡ识别位点已被甲基化,PCR鉴定EcoRⅡ甲基化酶基因已稳定整合到细胞染色体上。     

DJ-1~（L166P）与DJ-1~（M26I）基因对NIH3T3细胞增殖和凋亡的比较

目的在细胞学水平比较DJ、DJ-1M26 I、DJ-1L166 P基因对NIH 3T3细胞增殖速率与凋亡的关系,为建立转基因动物模型及帕金森疾病发病机制研究奠定基础。方法分别将pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒脂质体方法转染NIH 3T3细胞,500μg/ml G418压力筛选稳定克隆,对3种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和Annexin V-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测。结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1、pcDNA3.1/myc-His-DJ-1L166 P和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26 I重组质粒转染NIH 3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个、4个、3个阳性细胞克隆,RT-PCR及Western blot方法进行DJ-1-His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,Caspase-3 RNA水平检测DJ-1L166 P和DJ-1M26 I组表达高于正常NIH 3T3细胞组,而DJ-1组caspase-3转录水平相对最低,MTT实验结果初步证明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率均低于DJ-1组和正常NIH 3T3细胞组（P〈0.05）,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞增殖速率与正常NIH 3T3细胞相比无明显差别;细胞凋亡检测表明转染DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因的NIH3T3阳性细胞凋亡率均高于正常NIH 3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH 3T3阳性细胞凋亡率低于正常NIH 3T3细胞（P〈0.05）。结论 DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变均降低NIH3T3细胞增殖速率,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变更易导致NIH 3T3细胞的凋亡,DJ-1L166 P和DJ-1M26 I基因突变对NIH3T3细胞增殖速率和细胞凋亡影响是相似的。     

G418对IL—2基因包装细胞的筛选

本文用高浓度的G418(800μg/ml)和低浓度的G418(200μg/ml)对包装细胞PLXSN/IL-2/PA317细胞进行40天的选择筛选培养,使其细胞呈稳定状态生长时,收集上清液转染NIH/3T3细胞,进行病毒滴度测定。试图在高选择标记的情况下筛选出高表达目的基因的包装细胞。实验结果表明:高、低浓度的G418对PLXSN/IL-2/PA317包装细胞的选择作用相同,即包装细胞的病毒滴度同选择标记物浓度无关。提示可用低浓度的G418来维持包装细胞的生命。     

Mo MLV gag-pol基因在NIH3T3细胞中的表达和鉴定

目的 构建含MoMLV gag-pol基因的重组表达载体,实现其在NIH3T3细胞中稳定表达。方法 应用RT-PCR方法反转录并扩增gag-pol基因,克隆入真核表达载体pcDNA4/HisMaxA上,构建重组表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol,用脂质体法转染NIH3T3细胞,Zeocin筛选稳定表达细胞株,通过SDS-PAGE分析检测表明, gag-pol基因在NIH3T3细胞实现了表达,产物相对分子质量(kD)为194.78×103。然后,将逆转录病毒载体导入此细胞系,包装逆转录病毒。用PCR与标记基因补救分析法检测野生型辅助病毒。结果 酶切鉴定的片段大小分别为5.2-kb,与预期大小一致,经Zeocin筛选后获得稳定表达细胞株,SDS-PAGE实验表明产物融合蛋白相对分子质量(kD)为194.78×103,与预期相符。脂质体转染包装细胞,嘌呤霉素加压筛选出高病毒滴度(4.0×106CFU/ml)的细胞克隆,且未检测到辅助病毒。结论 本工作构建的融合表达载体pcDNA4/HisMaxA-gag-pol及其在NIH3T3细胞中的表达,构建成功具有靶向性的逆转录病毒包装细胞系,该细胞系能够包装出高滴度的逆转录病毒,为肝细胞的基因治疗提供了一种新的基因转移系统。     

EphA3基因稳定表达细胞模型的建立与分析

目的：建立稳定表达外源EphA3基因的小鼠成纤维细胞株模型,初步探讨EphA3基因表达对肿瘤发生、发展的影响。方法：通过脂质体介导的方法,将真核表达载体pcDNA3.1（-）/myc-his-EphA3转染NIH3T3细胞,用Western印迹确定外源EphA3基因表达;通过MTT实验、软琼脂集落形成实验,观察EphA3基因表达对NIH3T3细胞生物学特性的影响。结果：建立了稳定转染EphA3基因的NIH3T3细胞株;EphA3基因表达的小鼠成纤维NIH3T3细胞生长速度没有明显变化,但在软琼脂上锚着非依赖生长的能力加强。结论：建立了稳定表达外源EphA3基因的NIH3T3细胞株,EphA3基因稳定表达具有诱导正常NIH3T3细胞发生恶性转化的重要生物功能。     

脑源性神经营养因子受体trkB在NIH 3T3细胞上的表达

构建了克隆有大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）受体trkB全长基因的真核表达载体pcDNA3.1( )-rat trkB.用脂质体介导法将重组载体转入小鼠NIH3T3细胞,在mRNA和蛋白质水平检测到了trkB基因在用G418筛选到的抗性NIH 3T3细胞中的表达,表达的trkB蛋白定位于细胞膜上。BDNF能够剂量依赖性地促进NIH 3T3－trkB细胞的增殖,说明表达的trkB是有功能的。该表达trkB和NIH3T3细胞为研究BDNF的生理功能、活性测定和从噬菌体展示肽库中筛选BDNF肽提供了一个简便的细胞模型。     

IL2-TNFα基因诱导大鼠C6胶质瘤细胞凋亡

目的为深入进行胶质瘤细胞凋亡的分子生物学研究及为提高胶质瘤辅助免疫治疗打下基础.方法通过光镜、电镜、荧光显微镜分析,DNA断裂分析及流式细胞仪分析,进行通过IL2-TNFα诱导C6胶质瘤细胞凋亡研究.结果本研究用脂质体将pLXSN-IL2-TNFα基因导入病毒包装细胞PA317,经G418抗性筛选,用NIH3T3细胞测得病毒滴度为5×10\+5CFU/ml的细胞克隆,利用病毒上清感染C6细胞,测得IL2的生物活性为2.0～8.0U/10\+6cells/24h,测得TNFα生物活性为3～110U/10\+6cells/24h,实验证实在作用72h后,C6细胞出现细胞凋亡;光镜和电镜可见细胞形态学上出现细胞皱缩,染色质浓集贴边;流式细胞仪结果显示有凋亡峰出现,凋亡细胞占细胞总数14.0%±1.3%;荧光显微镜观察出现染色质浓集、断裂;DNA电泳表现出DNA呈梯状带断裂.结论上述结果提示用IL2-TNFα成功诱导大鼠C6胶质瘤细胞发生凋亡.     

NIH／3T3，C-11细胞基因文库的构建以及成纤维蛋白质DNA片段克隆的分离

本文以λAGTl0为载体,用两种不同的方法建立了NIH／3T3,C-11细胞基因文库,所得重组子值分别为：6×10⁵pfu,2.5x10⁶pfu,1.8x10⁶Pfu,1.4×10⁶pfu均超过了建库要求的理论值。并且从C-11细胞基因文库中分离出成纤维蛋白质DNA片段克隆,使得这-DNA片段竞隆到PBR322质粒中。     

pcDNA3与pIRES1.neo筛选克隆效率的比较

将绿色荧光蛋白(GFP)报告基因分别插入pIRES1.neo与pcDNA3二真核表达载体,构建pGFP-IRES1.neo和pcDNA3-GFP,转染小鼠B16细胞和人HepG2细胞,经G418筛选出抗性克隆,在倒置荧光显微镜下观察,鉴定共表达克隆数;结果在两个细胞系中,pcDNA3-GFP共表达率分别为0%和4%,而pIRES1.neo-GFP共表达率为75%和100%,差异非常显著;因此在筛选稳定表达目的基因细胞克隆的实验中,pIRES1.neo是一个较理想的载体。     

人sTNFR1基因的克隆以及在NIH3T3细胞中的稳定表达

以He1a细胞的总RNA为模板,用RT—PCR方法扩增sTNFR1全编码区基因片段,构建含有目的片段的T载体克隆及真核表达载体pcDNA3．1（-）重组质粒亚克隆,将重组质粒和脂质体共同转染NIH3T3细胞系,G418筛选稳定转染细胞株．经核苷酸序列测序和酶切鉴定,成功构建了pcDNA3．1（-）-sTNFR1真核表达质粒,脂质体法建立了高效表达sTNFRI的稳定转染细胞系,并经RT—PCR和Western Blotting鉴定．人sTNFR1基因能在NIH3T3细胞系中稳定表达,为今后的研究打下了基础．     

表皮生长因子对neu基因表达的诱导作用(简报)

Shih等首次通过NIH/3T3细胞转染试验在乙基亚硝脲(ENU)诱导的大鼠神经胶质纤维瘤中分离鉴定出一种转化基因,称之为neu基因,其表达可导致培养的NIH/3T3细     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

CD/5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞的杀伤作用

采用分子克隆技术构建含卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi’s sarcoma—associated herpesvirus,KSHV)转化基因K12和含胞嘧啶脱氨酶(CD)基因重组逆转录病毒表达质粒,分别命名为LZRS-K12和pLXSN—Fcy∷Fur。将LZRS-K12质粒转染NIH3T3细胞系,诱导细胞转化获得具有肿瘤细胞生物学特性的N／K12细胞,进一步将pLXSN—Fcy∷Fur质粒转染N／K12细胞,获得含CD基因的N／K12／FF细胞。加入5-氟胞嘧啶(5-FC)后,采用MTT法、流式细胞仪和免疫组化(IHC)等方法,分别检测细胞存活率、凋亡率及凋亡相关蛋白的表达。结果显示,N／K12／FF细胞在使用5-FC后存活率明显下降。流式细胞仪检测结果显示,5-FC作用后的N／K12／FF细胞的凋亡率与作用前相比增加了4．6％。与此同时,经5-FC作用后的N／K12和N／K12／FF细胞的生长周期发生了明显变化,均表现为G0-G1期细胞比率降低,S和G2-M期细胞比率增高。5-FC使得N／K12细胞的增殖主要阻滞在G2-M期,而N／K12／FF细胞的增殖主要阻滞在S期。IHC检测结果表明,N／K12细胞在5-FC使用前后Fas和Fas-L表达改变均不明显;而N／K12／FF细胞在5-FC使用后的Fas和Fas-L表达水平均明显高于5-FC使用前的水平。提示,CD／5-FC对KSHV肿瘤转化基因K12诱导NIH3T3转化细胞具有杀伤作用;凋亡有可能介导了部分杀伤过程;Fas和Fas-L有可能部分参与凋亡的诱导。     

雷公藤单体T10对Aβ1-42所致PC12细胞凋亡的抑制作用

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是发病率最高的中枢神经系统退变性疾病.目前AD的病因不清,亦无有效的防治手段,其重要的原因是尚无适宜的AD模型.因此,本实验首先建立了PC12细胞系β淀粉样蛋白(p-amyloid,Aβ)细胞损伤模型,在此基础上,探讨了中药免疫抑制剂雷公藤单体T10对细胞的保护作用及其机制.首先用不同浓度的Aβ(5×10、5×10-3、5×10-2、5×10、5、50 μmol/L)与PC12细胞共孵育48 h,用MTT法检测细胞存活率.选取Aβ致使细胞存活率降低的浓度(0.5、5、50 μmol/L)与PC12细胞共孵育48 h,通过流式细胞仪检测凋亡细胞百分比.用1×10-11mol/L的T10预孵育PC12细胞48 h后,加入50μmol/L Ap共孵育48 h,亦用流式细胞仪检测凋亡细胞百分比,激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子浓度变化.结果显示,Aβ的浓度存50μmol/L时可使细胞存活率降低至55.1%,凋亡细胞比例显著增加,而1×10-11mol/L的T10可明显降低50 μmol/L Aβ诱导的PC12细胞死亡.50 μmol/L Aβ可促进PC12细胞胞外钙离子内流,1×10-11mol/L的T10对Ap诱导的胞外钙离子内流有抑制作用.这些观察结果表明T10对Ap导致的PC12细胞损伤具有明显的保护作用,其机制可能与抑制Aβ诱导的胞内钙离子浓度升高和细胞凋亡有关.     

人体细胞漫谈

人体细胞的数目人和所有行有性生殖的生物一样,都是由一个细胞——受精卵发育而来的.据推算,刚出生的婴儿全身约有二十万亿(2×10~(18))个细胞.经过二十多年的分裂生长,成人体内细胞约为三百万亿(3×10~(14))个. 据估算,人体神经系统内含有10~(11)个神经细胞(又叫神经元),仅大脑皮层就约含140亿个神经细胞.如果以成人体内血量平均为4.5升计算,成年男性体内红细胞约为2.25×10~(10)个(500万个/mm~3×4.5×10~3);女性体内红细胞约1.89×10~(10)个(420万个/mm~3×4.5×10~3;白细胞2.25×10~7～4.5×10~7个;血小板约为4.5×10~8～1.35×10~9个.     

人乳头状瘤病毒癌蛋白E6和E7双标记质粒的构建及应用

目的:构建人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)-16 E6、E7癌蛋白及其突变型的双筛选标记质粒并筛选出稳定表达HPV-16癌蛋白的肺癌A549细胞株。方法:以携带新霉素抗性基因neo的pEGFP质粒(pEGFP-N1)为空载体,在EcoRⅠ和BamHⅠ位点间插入HPV-16 E6、E7及其突变型基因。新构建的质粒鉴定后转染A549细胞并用G418筛选,多次挑取单克隆后用流式细胞仪分选带荧光的细胞。结果:PCR、双酶切鉴定结果及DNA序列测定结果均证实质粒构建正确;PCR扩增结果显示细胞中存在目的基因;流式细胞术结果显示细胞阳性率高;Western blotting结果显示细胞能表达HPV-16 E6、HPV-16 E7蛋白。结论:成功构建pEGFP-E6、E7质粒并筛选出稳定表达E6和E7癌蛋白的A549细胞株,为进一步研究HPV对肺癌的影响奠定了基础;同时发现G418筛选结合流式细胞仪分选可提高稳定转染细胞的阳性率。