大片段DNA插入文库的研究进展

基因组DNA大片段插入文库作为基因组学和基因克隆的技术平台,它的发展主要经历了Cosmid文加,YACs文库,BACs文库三个阶段,文中对几种文库作了简单的比较和评价,对大片段文库的应用人了比较详实的介绍。作者根据自己的建库经验,重点介绍了BAC文库的构建。     

噬菌体cDNA文库筛选方法的改良

cDNA文库的构建和简便、快速的筛选是获得全长基因的重要途径,基于PCR的筛库方法具有快捷、灵敏的特点。研究改进了基于PCR的噬菌体cDNA文库筛选方法,用液体分装的方法,替代了文库筛选的关键步骤——涂板分区,省去了噬菌体文库铺平板、浸染、培养、划块洗脱的操作过程,使筛库的工作量减少,进一步提高了筛选速度和获得阳性克隆的效率。     

细菌人工染色体基因组文库构建方法的改进

目的:建立一种改进的更简便、易操作的细菌人工染色体(BAC)文库构建方法。方法:在构建猪霍乱沙门氏菌基因组大片段DNA的BAC文库时,对改进的基因组BAC文库构建方法和常规的BAC文库构建方法进行比较。结果:利用改进的方法可简便快速地构建猪霍乱沙门氏菌基因组BAC文库。结论:使用2种方法构建BAC文库,其转化效率,以及在BAC克隆中插入的DNA片段的大小和BAC克隆的稳定性等都相同,从而表明改进的方法更简单、更方便,它能使BAC文库的构建更为高效。     

B3HM细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及表达

目的: 利用噬菌体展示技术构建B3HM细胞免疫小鼠的脾细胞表达scFv文库。方法: 用人骨髓细胞系B3HM细胞免疫小鼠,取其脾细胞采用RT-PCR方法扩增VH 和Vk基因并克隆入噬菌体展示表达载体,构建scFv文库,测定文库的库容量,BstNI酶切单克隆分析文库的多样性,对文库进行富集检测,鉴定单克隆噬菌体与B3HM细胞结合反应。结果:文库的库容为5×106cfu,单克隆的BstNI酶切图谱显示多样性,单克隆噬菌体抗体与B3HM细胞呈阳性反应。结论:噬菌体展示文库的成功构建为寻找新的致白血病相关基因,阐明白血病发病机理奠定了基础。     

基因组文库的构建和池化筛选

作为物种保护策略的重要部分,建立濒危畜禽的基因组文库,可有效保存濒危畜禽种质资源。BAC(bacterialartificial chromosome)文库具有高容量、遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建。对BAC文库的构建方法和文库池化筛选系统作一综述。     

RNA干扰文库在功能基因组学研究中的发展及应用

RNA干扰（RNAi）是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性转录后基因表达沉默,从基因组水平设计针对多个靶基因的RNAi序列,建立RNAi文库进行系统性、大规模的筛选工作是功能基因组学研究的有力工具。目前RNAi文库主要包括质粒（或病毒）文库、siRNA表达盒文库、寡核苷酸文库和随机RNAi文库,已经被成功应用于基因功能鉴别、信号转导途径解析和药物靶标筛选等研究领域。近年来,这一领域发展迅速,本文就RNAi文库的发展应用以及存在的问题与展望进行综述。     

噬菌体展示肽文库及其应用

肽库是研究与特定靶分子高亲和结合配体的有力工具,肽文库可被分为合成文库和噬菌体肽文库两类,作者综述了噬菌体肽文库及其蛋白质结构域分析定位,疫苗研制及抗原表位分析和药物设计等方面的应用。     

毛竹笋全长cDNA文库构建

Gateway技术构建cDNA文库,利用了λ噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。应用Gateway技术构建毛竹笋cDNA文库,经检测cDNA入门文库的滴度达到1.7×106cfu/mL,文库总容量为8.5×106cfu,平均插入片段在1.0 kb以上。毛竹笋文库的构建为进一步克隆毛竹纤维化分子机理打下了基础。     

野生一粒小麦BAC文库的构建和鉴定

以细菌人工染色体pECBAC1为载体 ,构建了野生一粒小麦 (TriticumboeoticumBoiss)的基因组BAC文库。该文库共包含约 17万个克隆 ,平均插入片段长度为 10 4kb ,按野生一粒小麦基因组为 5 6 0 0Mb计算 ,文库覆盖了约 3倍的该物种基因组。用大麦叶绿体psbA基因和玉米线粒体atp6基因作混合探针 ,检测发现该文库中含细胞器基因组同源序列的克隆数小于 1%。该文库的建成 ,为小麦基因的克隆及基因组学研究提供了技术平台     

一种用于构建红色红曲霉基因组Cosmid文库的大片段DNA制备方法

摘要：【目的】制备用于构建红色红曲霉cosmid文库的大片段基因组DNA。【方法】采用优化的酚氯仿抽提法制备DNA,并利用Sau3AI切割至平均大小为40 kb,然后使用Stratagene包装蛋白构建cosmid文库。基于PCR法使用同源探针从该文库中进行了目的基因的筛选。【结果】制备了浓度为5 μg/μL,平均片段大小大于48 kb的红色红曲霉大片段基因组DNA。利用该DNA构建的cosmid文库基因组覆盖倍数为10,并筛选到了含有目的片段的cosmid。【结论】通过该方法制备红色红曲霉大片段基因组D     

采用诱导环化酶制备Illumina Mate-paired DNA文库

新一代测序技术(NGS)的文库制备方法在基因组的拼装中起着重要作用。但是NGS技术制备的普通DNA文库片段只有500 bp左右,难以满足复杂基因组的从头(de novo)拼装要求。三代测序技术的读长可以达到20 kb,但是其高错误率及测序成本过高使得其又不易推广。因此二代测序的Mate-paired文库制备技术一直在基因组的de novo拼装中扮演着非常重要的角色。目前主流的NGS平台Illumina制备的Mate-paired文库的片段范围只有2~5 kb,为了得到更长的可用于Illumina平台测序的Mate-paired文库,本研究首次整合并优化了Illumina和Roche/454两种测序平台的Mate-paired文库制备技术,采用诱导环化酶来提高基因组长片段DNA的环化效率,成功建立了20 kb Mate-paired文库制备技术,并已将该技术应用于人类基因组20 kb Mate-paired文库制备。该技术为Illumina平台制备长片段Mate-paired库提供了方法指导。     

几种全长cDNA文库构建方法比较

全长cDNA文库是高效、大规模获得基因全序列信息的一条有效途径,尤其是对基因组庞大,近期内尚不能进行全基因组测序的生物来说,是一条开展功能基因组研究的重要途径。本文对几种全长cDNA文库的构建方法进行了概述,针对各种方法的原理及优缺点做了分析、比较,并结合本实验室的结果,重点介绍了Cap-trapper法在小麦全长cDNA文库中的应用及文库中全长基因比例判定方法。     

噬菌体表面呈现技术研究进展

噬菌体表面呈现技术是1985年建立的一种将外源基因表达呈现在噬菌体颗粒表面的方法,可用于建立随机多肽文库、抗体文库等。经特定配基的筛选,可获得与其特异结合的配体分子。通过改构,还可将cDNA产物表达于噬菌体颗粒的尾部构建cDNA文库。SIP技术通过将配体和配基分别与基因Ⅲ蛋白的C末端和N末端融合表达,基因Ⅲ的C-末端参与噬菌体颗粒的组装,配基与配体的结合能够重建基因Ⅲ蛋白的功能,才能形成有感染能力的噬菌体,这样就大大提高了筛选效率。     

莱茵衣藻基因组文库的构建

以莱菌衣藻CC-849为材料,提取基因组DNA,利用BamHⅠ和BglⅡ对基因组DNA进行酶解,获得了可用于构建基因组文库的6-12 kb的基因组片段,并浓缩至200 ng/μL。该片段与λDNA载体连接,经噬菌体蛋白包装、侵染大肠杆菌XL1-blue后,获得了莱菌衣藻基因组文库。该文库的滴度为2.12×10~5 pfu/mL,共有转化子4.26×10~4个,插入片段的平均长度约为9kb,扩增后基因组文库滴度为9.5×10~6 pfu/mL。     

应用改进的多聚组氨酸标签T7表达载体构建肺癌cDNA文库

应用噬菌体C端展示系统构建的cDNA文库缺乏开放阅读框筛选机制,文库中多数噬菌体克隆展示框外非天然短肽,给后期蛋白质的筛选带来了不便. 为实现噬菌体的ORF筛选功能,利用PCR技术对已有载体T7Select10-3b进行改造,在MCS处外源cDNA插入位点的3′端引入6聚组氨酸筛选标签,经包装后挑取成功表达的单克隆构建肺癌cDNA文库. 经镍柱亲和层析后,收集文库中表达组氨酸的克隆,利用化学发光免疫试验进行筛选效果鉴定. 结果显示,改造的新型载体可成功表达组氨酸标签,以此构建的肺癌cDNA文库经筛选后,含ORF插入的克隆由筛前的6 %提高至70 %,本研究为提高cDNA文库的质量提供了一种简便可行的方法.     

噬菌体抗体库的优化

噬菌体抗体组合文库技术作为噬菌体展示和抗体组合文库两种技术的集成,由于它具有库容量大、特异性高、和敏感性强的优点而被誉为抗体技术的第三次革命。但是由于一些技术上的原因,使得它无法得到广泛的应用,本文就其优化进行综述。     

细菌人工染色体文库的构建方法分析

细菌人工染色体是一种承载大片段DNA的新型载体系统,它具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点.在高等生物基因组文库的构建和基因功能的分析等方面有广泛应用.BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础.介绍了近年来细菌人工染色体文库构建方法上的研究进展,对其中载体的制备和高分子量DNA的制备这两个关键环节作了较深入的探讨.     

云南药用野生稻核基因组细菌人工染色体(BAC)文库的构建与分析

通过云南药用野生稻核基因组BAC文库的构建,保存处于濒危状态的云南药用野生稻遗传资源,该文库包含27 500个克隆,随机挑取80个克隆检测,插入片段平均大小为80kb,文库容量相当于水稻基因大小的5.1倍。     

植物基因富集研究进展

高等植物的基因组大小差异十分巨大, 在大基因组植物的基因组中, 各种重复序列占据了基因组中相当大一部分, 而低拷贝或单拷贝的基因序列仅占了很少一部分。对于大基因组物种而言, 大量的重复序列给基因组的研究工作带来很大困难, 使得大规模获得基因信息成为一项很有挑战性的工作。目前, 在基因组范围内富集基因的方法有cDNA文库、甲基化过滤文库、高Cot值文库、转座子标签富集法等。文章综述了这几种方法的技术原理和特性, 结合近年来国内外运用甲基化过滤技术的研究进展, 探讨了根据不同研究材料和研究目标, 如何高效选择适合的方法或者方法的组合。     

cDNA文库及其在原虫研究中的应用

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具.从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达.由于cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用,因此其应用也日益广泛.简要介绍自cDNA文库创建以来,发展起来的各类文库及其构建cDNA文库的方法.作者重点阐述了弓形虫、利什曼原虫、阴道毛滴虫、疟原虫等原虫cDNA文库的构建及其应用.