北京油鸡ADSL基因的克隆、表达及其结构与功能分析

采用RT-PCR与RACE方法扩增出北京油鸡腺苷酸琥珀酸裂解酶(ADSL)基因全长cDNA序列,亚克隆和序列分析结果表明:该基因开放阅读框长为1455个碱基,编码485个氨基酸;5'端非转录调控区具有典型管家基因的特征,在临近起始密码子27号碱基发生C→T突变,该突变使得本来小是核呼吸因子2(NRF-2)结合位点的CTCC突变为NRF-2结合位点CTTC.将ADSL基因完整斤放阅读框重组至融合表达载体pGEX-4T-l中,构建成北京油鸡ADSL基因融合表达载体pOEX-ADSL,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆,IPTG诱导表达.经SDS-PAGE电泳显示重组融合蛋白在约80.5kD处有特异蛋白条带出现,与预期分子量大小一致,等电点为6.79.该蛋白的表达最随诱导时间的延长而增加,5h达最高值,达到细胞总蛋白的26.9%,且主要以不可溶的包涵体形式存在,经优化表达条件,成功地获得了可溶性的融合蛋白,经Glutathione Sepharase 4B凝胶纯化后Western blotting检测表明其为北京油鸡ADSL蛋白,为其进一步的生物学功能及其应用研究鉴定基础.     

细菌人工染色体的修饰及其转基因应用研究

细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)是一种新发展起来的DNA载体系统,它具有容量大、遗传特性稳定、易于操作等优点.广泛的应用于基因组文库构建、基因功能分析等方面.随着基因组测序工程的实施与完成,如何对包含完整基因信息的特定细菌人工染色体进行有目的修饰已成为功能基因组学研究的一个重要环节.BAC载体转基因技术可能成为避开基因打靶获得高效表达的转基因生物的另一途径.本文介绍了BAC作为转基因载体的几种修饰方法及其在转基因研究上的应用.     

动物生物反应器建立的主要方法与技术

本文在查阅大量国内外相关资料的基础上,结合具体的实验操作原理和规程,就建立动物生物反应器模型的方法与技术、转基因动物的应用和转基因动物存在的问题等进行了概括性的论述。其目的在于为进一步探讨转基因的科学原理、最佳操作方法和技术,提高转基因的效率,建立理想的动物生物反应器等奠定基础。     

G蛋白偶联受体40研究进展

G蛋白偶联受体40(G protein-coupled receptor 40, GPR40)是一种具有7个跨膜α螺旋结构的G蛋白偶联受体, 主要分布于胰腺细胞和神经系统细胞。它能与机体内游离的中长链脂肪酸结合, 激活细胞内信号通路, 从而调节其生理功能。在胰岛细胞中, GPR40可被游离脂肪酸激活, 促使细胞内钙离子浓度升高, 进而促进胰岛素释放。根据这一机理, 以GPR40为靶点的激动剂类药物相继被开发, 用于糖尿病治疗。GPR40也参与神经发生过程, 但到目前为止其相关机制尚不清楚。文章从基因结构、表达调控、蛋白配体及应用、生理功能等方面详细介绍了GPR40的研究现状, 总结了目前研究中所遇到的问题, 并对未来的研究热点进行展望。     

IL-18在临床疾病中的作用

IL-18是新发现的一种细胞因子,它具有诱生IFN-γ的作用,在抗感染、抗肿瘤、免疫性疾病及免疫调节等诸多方面发挥着重要作用.本文就IL-18的来源、结构特点、生化性质、生物学作用及其在临床疾病中的作用做一简单综述.     

细菌人工染色体文库的构建方法分析

细菌人工染色体是一种承载大片段DNA的新型载体系统,它具有插入片断大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点.在高等生物基因组文库的构建和基因功能的分析等方面有广泛应用.BAC文库的构建是基因组较大的真核生物基因组学研究的重要基础.介绍了近年来细菌人工染色体文库构建方法上的研究进展,对其中载体的制备和高分子量DNA的制备这两个关键环节作了较深入的探讨.     

细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究

基因组文库是进行分子克隆和基因结构与功能研究的基础,完整覆盖的基因组文库的构建,使基因组任何DNA片段的筛选和获得成为可能.细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)与其它载体系统相比具有转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收,高覆盖率、稳定性强,并且具有易分离和操作等特性等优点而被广泛应用.作为物种保护策略的重要部分,构建我国濒危动植物品种基因组BAC文库,对于其遗传资源的保护和研究具有非常重要的作用.在查阅大量国内外相关资料的基础上,就BAC基因组文库构建过程中栽体的制备、高分子量DNA的制备、大片段DNA的回收、连接与电击转化、基因组BAC文库质量鉴定等几个重点、难点问题进行了详细的论述和分析,对于构建高分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因组文库提供理论基础与技术支撑.     

北京油鸡purH基因结构与表达特征研究

提取北京油鸡8种组织的总RNA,利用RT-PCR检测purH基因mRNA的差异表达。将purH基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-N3,构建带有GFP报告基因重组表达载体pEGFP-purH,利用脂质体介导法将其导入北京油鸡体外培养细胞中,进行G418药物筛选和克隆化培养。结果表明：北京油鸡purH基因（GenBank 登录号：EU334506）编码区为1782 bp,编码 593 aa的多肽,转染后24 h、48 h和72 h,pEGFP-purH转染率在10.3 %～53.2 %之间,绿色荧光均匀分布于细胞质与细胞核中,随表达量的增加,绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状。经药物筛选和克隆化培养,获得表达pEGFP-purH融合蛋白的克隆细胞株,RT-PCR与Western blotting检测确认pEGFP-purH已整合到北京油鸡成纤维细胞基因组中,在优化的条件下,阳性细胞凋亡率、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著（P 〉0.05）。     

转基因动物克隆技术的应用及生物反应器的建立

利用转基因克隆技术实现外源基因的导入宿主染色体基因组内稳定整合,并能遗传给后代,已在基因表达与调控的理论研究、人类遗传病动物模型的建立、药用蛋白的生产、抗病育种、人类移植用的器官的研究等方面得到广泛应用。转基因动物的研究与应用也已经成为21世纪生命科学领域最活跃、最具有实际应用价值的方向之一,尤其是作为生物反应器和医学上为人类提供所用器官方面,其经济价值和社会效益将是不可估量。在查阅大量近年来国内外相关资料的基础上,本文以转基因动物克隆为中心,对转基因动物克隆所采用显微注射技术、核移植技术、基因打靶与真核BAC表达载体制备等主要研究技术,以及转基因动物克隆在异种器官移植、构建生物反应器等方面的应用进行了综合性论述与分析,同时阐述了各种转基因技术的优点与缺点,以其为转基因动物克隆研究提供理论基础与技术支撑。     

北京油鸡α1-AGP基因结构与表达特征研究

提取北京油鸡心、肝、脾、肺、肾、脑、腿肌与胸肌等不同组织的总RNA, 利用RT-PCR方法检测a1-酸性糖蛋白基因(a1-AGP)mRNA的差异表达。将a1-AGP基因完整开放阅读框定向插入pEGFP-C1, 构建带有GFP报告基因的重组表达载体pEGFP-α1-AGP, 将其导入北京油鸡体外培养细胞中, 并进行G418药物筛选和克隆化培养。结果表明: a1-AGP基因开放阅读框长度为612 bp, 编码203个氨基酸, 在北京油鸡肝、肺、腿肌和胸肌中有表达; 转染后24、48和72 h, pEGFP- a1-AGP转染率在31.3%~47.6%之间, 绿色荧光主要集中在细胞核中, 随着表达量的增加, 绿色荧光在细胞核中聚集成团块状或颗粒状, 经药物筛选和克隆化培养, 获得表达pEGFP-a1-AGP融合蛋白的阳性克隆细胞株, 利用RT-PCR与Western blotting检测确认pEGFP-α1-AGP已整合到北京油鸡成纤维细胞的基因组中, 在优化的条件下, 阳性细胞凋亡率、形态、生长与增殖状况与对照组比较差异不显著(P >0.05)。