真核表达载体pEGFP—N1-VP3的构建及在SGC-7901细胞中的表达和定位

构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3并稳定转染人胃癌细胞SGC-7901,观察EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中的分布和亚细胞定位,探讨凋亡素诱导肿瘤细胞凋亡的机制.用PCR技术扩增出(凋亡素)VP3基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建的重组质粒pEGFP-N1-VP3经脂质体介导转染SGC-7901细胞,在荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察凋亡素在肿瘤细胞中的分布、亚细胞定位.用AO/EB荧光染色法检测其在体外诱导肿瘤细胞凋亡的效应.经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已插入载体pEGFP-N1,稳定转染细胞中EGFP-VP3在肿瘤细胞中得以高表达,转染后逐渐从细胞质迁移至细胞核,最后定位于细胞核内.AO/EB荧光染色观察到大量细胞凋亡.结论:成功构建真核表达载体pEGFP-N1-VP3,并成功培养出表达绿色荧光蛋白和凋亡素的SGC-7901稳定细胞株.EGFP-VP3融合蛋白在肿瘤细胞中具有核定位效应,并诱导肿瘤细胞凋亡.     

大鼠大麻素Ⅰ型受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠大麻素型Ⅰ受体绿色荧光融合蛋白真核表达载体并观察其在细胞中的表达。方法:大鼠CB1基因序列设计引物,以大鼠脑组织为模板扩增CB1基因编码区片段,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N3中,构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,通过观察EGFP报告基因的表达以及免疫荧光,Western Blot方法鉴定CB1可在真核细胞中过表达情况。结果:构建重组融合蛋白表达载体pCB1-EGFP,单双酶切和测序验证正确。将pCB1-EGFP质粒转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察到融合表达的绿色荧光蛋白,且呈胞膜表达。免疫荧光试验也证明重组载体转染后,CB1基因和GFP共同定位于胞膜部分。Western Blot实验证明表达CB1蛋白。结论:成功构建了高表达的CB1-EGFP融合蛋白真核表达载体。     

大鼠p75NTR荧光真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

目的:构建大鼠p75神经营养素受体(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)cDNA序列的绿色荧光真核表达载体并鉴定其在人胚肾293(human embryo kidney 293,HEK293)细胞中的表达.方法:采用PCR方法从含野生型大鼠p75NTR的pDC316-RP75质粒中扩增目的片段,经EcoRⅠ和SaⅡ双酶切,定向克隆于pEGFP-N1质粒中,构建绿色荧光真核表达栽体pEGFP-N1-RP75,经酶切及测序鉴定后,通过脂质体转染HEK293细胞,激光共聚焦及免疫组织化学法鉴定大鼠p75NTR的表达.结果:重组质粒经酶切鉴定和序列分析证实含有大鼠p75NTR的编码序列,转染后经激光共聚焦显微镜及免疫组织化学染色观察表明重组质粒能够在HEK293细胞中表达出具有活性的大鼠p75NTR片段.结论:大鼠p75NTR绿色荧光真核表达栽体构建成功并可在HEK293细胞中表达,为进一步研究奠定了基础.     

过氧化物酶蛋白1 真核表达载体构建及在Hela 细胞的表达与定位

目的:构建过氧化物酶蛋白1(PRDX 1)的真核表达载体,观察其在Hela细胞内表达及定位。方法:提取BALB/c小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-PCR方法扩增得到小鼠PRDX 1编码序列,酶切后克隆至pcDNA3-myc载体。重组质粒通过PCR、酶切、测序证明构建正确后经脂质体转染Hela细胞,然后利用Western blot和荧光显微镜技术观察该融合蛋白在细胞内表达及定位。结果:经鉴定证明重组质粒构建正确;Western blot实验显示,该质粒能够在Hela细胞中特异表达;免疫荧光试验显示,蛋白产物分布在胞浆和胞核,证明该蛋白在细胞内高表达。结论:成功构建带有myc标签的PRDX 1真核表达载体,该质粒能够在哺乳细胞中特异表达并且外源性PRDX 1蛋白分布在Hela细胞胞浆胞核内,为深入研究PRDX 1蛋白在细胞内相关生物学研究奠定了基础。     

人酸性调宁蛋白calponin-3与EGFP的融合表达及其细胞定位

调宁蛋白家族进化保守,广泛分布于肌细胞与非肌细胞。目前发现该蛋白家族有碱性、中性和酸性3个异构体,它们在非肌细胞中的功能尚不明确,而酸性调宁蛋白calponin-3是被研究最少的家族成员。本研究通过RT-PCR的方法从人支气管上皮细胞HBE中克隆编码calponin-3蛋白的CNN3基因,克隆至真核表达载体pEGFP-N1。重组质粒pEGFP-N1-CNN3经酶切鉴定和DNA测序正确后,用于瞬时转染细胞。Western blotting检测293T,A549和SMMC-7721细胞内重组绿色荧光融合calponin-3蛋白的瞬时表达,激光共聚焦显微镜分析calponin-3-绿色荧光融合蛋白与罗丹明-鬼笔环肽标记F-actin的细胞定位。结果表明成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-CNN3并在293T、A549和SMMC-7721细胞中高效表达;通过绿色荧光结合免疫荧光染色确定calponin-3与F-actin共定位。成功构建calponin-3蛋白的表达载体,在细胞中瞬时表达并检测其细胞亚定位,为进一步研究calponin-3蛋白的生物学功能奠定基础。     

人Tim-3 基因真核表达载体的构建及表达

目的:为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3(hTim-3)的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法:取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用BglⅡ和SalⅠ限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果:酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP-N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

人GNAS1基因克隆、真核表达载体的构建及瞬时转染Hela细胞

目的:克隆人GNAS1基因编码区序列、构建真核表达载体并瞬时转染Hela细胞。方法:通过RT-PCR克隆GNAS1基因编码序列,亚克隆至pMD19载体,测序鉴定正确后,通过酶切连接至真核表达载体pEGFP-N1,通过菌液PCR和酶切鉴定获得pEGFP-GNAS1重组质粒;表达载体以Lipofectamine2000介导转染Hela细胞,并用实时定量PCR检测外源基因在Hela细胞中的表达。结果:克隆到GNAS1基因并获得了pEGFP-GNAS1表达载体,在Hela细胞中获得了GNAS1的过量表达。结论:成功克隆了GNAS1基因编码序列,并构建其真核表达载体,瞬时转染至Hela细胞,为进一步深入研究Gsα蛋白生物学作用奠定基础。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG的构建及在HeLa细胞中的表达

为了将绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)引入细胞核内,采用两轮PCR方法从原先克隆在pcD-NA3.1(-)+GFP载体中将GFP编码序列扩增出来并引入Kozak序列和核定位信号,使用常规酶切和连接方法将其重组至pUCm-T克隆载体中,再将目的片段重组至pcDNA3.1(-)中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定后,构建了带有Kozak序列和核定位信号的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG。真核表达载体pcDNA3.1(-)+KG被转染试剂Su-perfect转染至HeLa细胞中,绿色荧光蛋白基因在HeLa细胞中得到表达而且在细胞核中观察到绿色荧光。该研究以绿色荧光蛋白为标记初步建立了活体观察真核细胞核动态变化的研究体系。     

小鼠Prx2正义和反义真核表达载体的构建与表达

目的:构建小鼠Prx2正义及反义真核表达载体pEGFP-Nl-sPrx2、pEGFP-N1-aPrx2并在小鼠卵巢颗粒细胞中表达。方法:应用RT-PCR技术,从小鼠卵巢颗粒细胞提取的总RNA中,获得Prx2基因编码序列的正义及反义片段,克隆至真核表达载体pEGFP-N1中,对重组质粒进行酶切和测序鉴定后,以脂质体介导法转染至体外培养的未成熟小鼠颗粒细胞,通过荧光显微镜观察和Westernblot检测其在颗粒细胞中的表达改变。结果:酶切和测序证明重组真核表达载体pEGFP-N1-sPrx2、pEGFP-Nl-aPrx2构建成功,荧光显微镜观察及Western blot确认目标蛋白在颗粒细胞中表达增强或减弱。结论:成功构建小鼠Prx2基因正义及反义真核表达载体pEGFP-N1-sPrx2、pEGFP-N1-aPrx2并在小鼠卵巢颗粒细胞中表达。     

人Tim-3基因真核表达载体的构建及表达

目的：为了构建可在真核细胞中高效表达人Tim-3（hTim-3）的真核表达质粒,以便用于hTim-3肿瘤免疫治疗研究。方法：取健康人外周血的单个核细胞,用高保真聚合酶扩增hTim-3基因,先进行hTim-3基因的亚克隆,用Bgl II和SalI限制性内切酶切下带有酶切位点的hTim-3基因,最终构建hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3。用脂质体方法转染质粒至肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937中。48h后荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光表达情况,初步判断转染效率。结果：酶切和测序鉴定证实目的基因hTim-3正确插入到真核表达载体pEGFP—N1中,转染肝癌细胞SMMC7721和巨噬细胞U937后,在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了可在真核细胞中高效表达hTim-3基因的真核表达质粒pEGFP-N1-hTim-3,为进一步研究hTim-3的肿瘤免疫治疗奠定了基础.     

Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达

目的：构建携带突变Kras基因,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法：PCR扩增突变Kras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7．5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;用WesternBlotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP—N1-Kras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的Kras基因的3’端;在Huh7．5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19％和53％;WesternBlott—ing也检测到融合蛋白的表达。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP—N1-Kras重组质粒载体,并且在Huh7．5和LMH中均稳定表达,为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。     

人P2X7真核表达载体的构建及稳定转染细胞株的建立

目的：构建人P2X7基因的真核表达载体,并通过转染获得稳定表达P2X7分子的HEK293细胞株。方法：以人脑组织P2X7cDNA为模板扩增出P2X7基因,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构建重组质粒pEGFP-N1/P2X7。用X-fect试剂盒将重组质粒转染HEK293细胞,通过G418辅助荧光筛选建立稳定表达P2X7-EGFP细胞株。经流式细胞仪、Western blot和激光共聚焦显微镜检测,了解人P2X7在HEK293细胞中的表达水平及细胞内定位。结果：重组质粒pEGFP-N1/P2X7构建正确,建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系。Western blot和流式细胞仪检测证实,P2X7在HEK293细胞系中成功表达,激光共聚焦显微镜检测显示P2X7-EGFP定位在细胞膜上。结论：重组载体pEGFP-N1/P2X7构建成功并建立了稳定表达人P2X7的HEK293细胞系,为进一步研究P2X7离子通道结构和功能奠定基础。     

Adenovirus vector-mediated FAM176A overexpression induces cell death in human H1299 non-small cell lung cancer cells

FAM176A (family with sequence similarity 176 member A) is a novel molecule related to programmed cell death. A decreased expression of FAM176A has been found in several types of human tumors in including lung cancers. In the present study, we investigated the biological activities of FAM176A on the human non–small cell lung cancer cell line H1299 cells. We constructed a recombinant adenovirus 5-FAM176A vector (Ad5-FAM176A) and evaluated the expression and anti-tumor activities in vitro. Cell viability analysis revealed that the adenovirus-mediated increase of FAM176A inhibited the growth of the tumor cells in a dose- and time-dependent manner. This inhibitory effect was mediated by both autophagy and apoptosis that involved caspase activation. In addition, cell cycle analysis suggested that Ad5-FAM176A could induce cell cycle arrest at the G2/M phase, all of which suggested that adenovirus-mediated FAM176A gene transfer might present a new therapeutic approach for lung cancer treatment. [BMB Reports 2014; 47(2): 104-109]     

准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698在真核细胞中的表达与鉴定

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N1-mpafp698,转染人胚肾293T细胞,并表达准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白MpAFP698.方法:PCR扩增出mpafp698序列,将其克隆入本室保存的真核表达载体pEGFP-N1中,转染293T细胞;利用RT-PCR、流式细胞仪、免疫荧光、Western 印迹检测蛋白表达.结果:构...     

人FAM92A1基因诱饵表达质粒的构建与鉴定

目的 构建人FAM92A1基因（hFAM92A1）的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.方法 PCR扩增hFAM92A1的基因编码序列并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,酶切和测序鉴定后,转化到酵母AHl09细胞中,Western印迹检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功构建FAM92A1基因的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1,测序结果正确.Western印迹实验证实酵母细胞高表达诱饵蛋白hFAM92A1,诱饵蛋白没有自激活作用.结论 构建的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1可用于下一步酵母双杂交系统实验,为进一步研究hFAM92A1功能奠定了基础.     

NAIF1对肝癌细胞 HepG2 增殖与迁移能力的影响

目的:在肝癌细胞Hep G2中过表达外源NAIF1(核凋亡诱导因子1),探讨NAIF1的亚细胞定位以及对Hep G2增殖和迁移能力的影响。方法:以真核表达质粒p EGFP-N1为对照组,p EGFP-N1-NAIF1为实验组,瞬时转染肝癌细胞Hep G2,利用免疫印迹方法检测NAIF1蛋白表达效率;以DAPI染核,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白定位,确定NAIF1的亚细胞定位;通过MTT方法绘制细胞增殖曲线;通过transwell小室法检测NAIF1对Hep G2迁移能力的影响。结果:在肝癌细胞Hep G2中,外源表达NAIF1主要定位于细胞核;与对照组Hep G2/p EGFP-N1相比,Hep G2/p EGFP-N1-NAIF1的细胞增殖、迁移能力下降(P<0.05)。结论:外源表达NAIF1蛋白定位于Hep G2细胞核,过表达NAIF1抑制Hep G2的细胞增殖与迁移能力,NAIF1可能作为肝癌治疗的潜在靶点。     

靶向白介素-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系的构建

目的：构建针对IL-1α基因的shRNA表达载体,筛选能够抑制Hela229细胞内源性IL-1α表达的shRNA,建立无内源性IL-1d表达的Hela229稳定细胞系.方法：根据shRNA的设计原则,以IL-1 αcDNA oligo为模板设计一段21 bp核苷酸目标序列,构建成siRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制IL-1α基因的重组shRNA质粒,转染Hela229细胞,经G418筛选后获得单克隆稳定细胞株,用ELISA方法在蛋白水平上检测IL-1α基因的沉默效果.结果：经酶切鉴定和测序分析确定IL-1 α-shRNA重组质粒构建正确,ELISA筛选出能够显著抑制内源性IL-1α表达的shRNA,获得沉默内源性IL-1 α表达的单克隆稳定的Hela229细胞株.结论：靶向IL-1α基因的重组shRNA表达质粒可显著抑制Hela229细胞内源性IL-1α的表达,成功构建靶向IL-1α基因沉默的Hela229稳定细胞系.