协同激活分子CBP诱饵表达质粒的构建和鉴定

构建协同激活分子CBP（CREB（cAMP response element binding）binding protein）的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.PCR扩增小鼠CBP的基因编码序列（CDS（coding sequence）序列）并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,通过酶切和测序鉴定后,把构建好的诱饵表达质粒pGBKT7-CBP转化到酵母AH109细胞中,Western blot检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果成功扩增了小鼠CBP基因的CDS序列,并成功克隆到酵母诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果正确.诱饵表达质粒成功转化到酵母AH109细胞中,Western blot分析结果证实酵母细胞高表达诱饵蛋白CBP,但诱饵蛋白有自激活作用.提示pGBKT7-CBP不能用于酵母双杂交或三杂交系统检测CBP与其他蛋白质或小分子的相互作用,对其他研究CBP生物学功能试验的方法选取具有一定的借鉴意义.     

体外诱导人脐带间充质干细胞向Ⅱ型肺泡上皮细胞分化

该研究旨在通过条件培养基诱导人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)向II型肺泡上皮细胞(type II alveolar epithelial cells,AEC2s)分化,为后续研究h UC-MSCs来源的AEC2s在肺部疾病中的治疗作用奠定基础。h UC-MSCs分为实验组和对照组,实验组用小气道上皮细胞生长基础培养基培养2天后添加生长因子诱导培养,对照组用20%血清的DMEM/F12培养。第14天观察细胞形态;Western blot、免疫荧光、流式细胞术和ELISA法检测肺泡表面活性蛋白C(surfactant protein C,SP-C)及前肺泡表面活性蛋白C(pro-surfactant protein C,pro SP-C)。利用透射电镜观察板层小体。结果显示,实验组细胞形态由长梭形向多边形转变,细胞内有pro SP-C表达,培养基上清中有SP-C分泌,透射电镜观察到板层小体;而对照组细胞形态无明显改变,未检测到pro SP-C表达、SP-C分泌和板层小体形成。该研究结果表明,体外诱导培养可促进h UC-MSCs向AEC2s分化,通过该方法有望大量获得h UC-MSCs来源的AEC2s用于肺部疾病治疗研究。     

全反式维甲酸拮抗地塞米松抑制人气道上皮细胞16HBE凋亡

该研究探讨全反式维甲酸(all-trans Retinoic Acid, ATRA)对GCs诱导人气道上皮细胞过度凋亡的拮抗作用。将人支气管上皮细胞16HBE作为研究对象,使用10μmol/L地塞米松(Dex)、1μmol/L ATRA处理细胞,体外培养16HBE细胞,分为Dex组、ATRA组、Dex+ATRA组和Control组。采用TUNEL法检测16HBE细胞凋亡情况, Annexin V/PI双染法检测膜磷脂酰丝氨酸外翻的情况,荧光探针JC-1检测线粒体膜电位变化, Western blot检测细胞的凋亡蛋白Caspase-3和其水解片段Cleaved-caspase-3的水平。相较于Control组, Dex组的TUNEL阳性细胞明显增多, Annexin V阳性蛋白明显上调,线粒体膜电位明显下降, Caspase-3和Cleaved-caspase-3的水平明显增高;联合ATRA则可以显著减轻Dex引起的这个趋势。因此, Dex可以导致人支气管上皮16HBE细胞的过度凋亡,而ATRA可以削弱Dex的这种作用。