棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析

为了建立棉铃虫Helicoverpa armigera性染色体的特异性分子标记,利用RAPD-PCR技术对雌雄棉铃虫基因组DNA进行筛选,从500种随机引物中筛选到1 条引物（Operon编号为AF-18）,可扩增出1条约450 bp 的雌性特异片段。经克隆测序并合成特异引物进行验证,表明该片段为棉铃虫雌性特异分子标记,位于W染色体上。利用家蚕、果蝇等昆虫Kettin基因序列,克隆了棉铃虫的同源基因HaKettin片段,并采用荧光定量PCR技术,以棉铃虫的DH-PBAN基因为参照基因,检测棉铃虫雌雄不同个体间HaKettin基因与DH-PBAN基因的拷贝数之比,结果表明：雄体HaKettin∶DH-PBAN=1.0,雌体HaKettin∶DH-PBAN=0.5,据此推断HaKettin基因位于棉铃虫Z染色体上。     

亚洲玉米螟幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶cDNA片段的克隆与序列分析

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶（prophenoloxidase activating proteinase, PAP）表达调控的分子机理, 本研究根据不同昆虫酚氧化酶原激活蛋白酶基因序列的保守区域, 设计合成简并引物, 采用RT-PCR技术从亚洲玉米螟5龄幼虫中扩增出PAP的一段cDNA片段, 大小为509 bp, 编码169个氨基酸, 预测分子量为18.7 kD, 理论等电点(pI值)为5.1。该基因序列中含有丝氨酸蛋白酶样结构域中保守的催化三联体, 不含发夹结构域。BlastP分析结果表明: 该片段的氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta PAP-3和冈比亚按蚊Anopheles gambiae发夹型蛋白B1的氨基酸序列一致性最高, 为47%; 与烟草天蛾PAP-2、家蚕Bombyx mori PPAE、 斜纹夜蛾Spodoptera litura PPAE-3、 蓖麻蚕Samia cynthia ricini PAP和黑腹果蝇Drosophila melanogaster丝氨酸蛋白酶7的氨基酸序列的一致性分别为45%, 45%, 44%, 43%和41%。构建系统发育树, 对其进化关系进行了初步分析, 结果显示: 亚洲玉米螟PAP与烟草天蛾PAP-3和斜纹夜蛾PPAE-3的亲缘关系较近, 与黑腹果蝇丝氨酸蛋白酶7和冈比亚按蚊发夹型蛋白B1的亲缘关系较远。这些结果说明克隆得到的cDNA片段为亚洲玉米螟幼虫PAP基因靠近羧基端的部分序列。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

斜纹夜蛾两个天蚕素D基因的克隆及序列分析

天蚕素是昆虫抵御病菌入侵的一类抗菌肽家族。根据斜纹夜蛾Spodoptera litura天蚕素B基因设计特异引物,通过PCR扩增得到2个新的天蚕素基因部分序列,分别命名为cecD1和cecD2（GenBank登录号分别为EF555567和EF555568）。2个基因编码同一个天蚕素D蛋白,该蛋白的成熟肽与天蚕素B存在2个氨基酸残基差异。序列分析发现cecD1和cecD2中分别包含568 bp和377 bp的内含子序列,它们有相同的5′和3′拼接位点,A+T含量分别为59.7%和69.8%,符合大多数真核生物内含子高A+T含量的特征。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

苏云金芽孢杆菌Rpp02菌株cry1Ac20基因的克隆及表达

Rpp02菌株是本实验室分离的一株对鳞翅目等多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni), 经PCR检测,它含有cry1Ac基因。对其基因组DNA进行PCR扩增,得到大约4 kb的产物。测序结果表明,该片段含有一个较大的ORF框,基因编码区为3 534 bp,编码1 177个氨基酸,分子量为133.144 kD,pI 4.952, 为弱酸性蛋白质,亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）3种氨基酸含量最高,分别为8.0%、7.8%、7.7%。该基因序列与cry1Ac序列同源性达到99%,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ac20。生物测定表明,该基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有较强的杀虫效果,试喂菜青虫48 h后,校正死亡率为88.78%。     

米蛾体内Wolbachia的wsp基因序列测定与系统发育分析

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生菌, 它们参与多种调控寄主的生殖活动机制。通过对wsp基因的特异性扩增和测序,发现了Wolbachia在米蛾Corcyra cephalonica (Stainton)体内的感染。利用所测序列和其他已发表的序列建立系统树,结果表明米蛾体内Wolbachia属于B大组的Pip类群,与其寄生物茧蜂及赤眼蜂中的Wolbachia各株系遗传距离相差较远。据此推测米蛾体内感染的Wolbachia不是由寄生物（茧蜂、赤眼蜂）水平传播所致。     

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1 569 bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1 590 bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得) 6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明：CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。     

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1 372 bp,开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66 bp和175 bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的分子进化分析

过PCR方法获得家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（egt）片段,序列分析表明该片段带有EGT的完整ORF,推测的多肽可形成EGT结构域的高级结构。为了研究egt的起源,利用家蚕基因组数据库,电子克隆了多个家蚕尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）基因,在此基础上进行了进化分析,表明BmNPV的EGT为antennal-enriched型UGT;推测核型多角体病毒（nucleopolyhedrivirus,NPV）和颗粒体病毒（granulovirus,GV）的egt基因在进化上来源于昆虫的UGT基因,但GV的egt基因在进化上的起源可能要早于NPV的egt基因;可能在昆虫祖先种进化形成不同昆虫目的某一时期,杆状病毒的祖先种从昆虫中获得了antennal-enriched型UGT基因,并进化为egt基因。家蚕的部分UGT基因与转座子元件连锁的基因组结构特点反映了杆状病毒的egt基因可能通过转座子的传递而获得。     

感染稻水象甲的Wolbachia基因组中插入序列的鉴定与分析

共生细菌Wolbachia对宿主的生殖起多种调控作用。以往研究表明, Wolbachia基因组中广泛存在插入序列(insertion sequence, IS), 它们对宿主基因组的可塑性、 多样性和进化起重要作用。稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel在东亚是一种外来水稻害虫, 在原产地北美营两性生殖, 而在所有入侵地均营孤雌生殖。本研究采用PCR法从河北唐海孤雌生殖型稻水象甲体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp4和ISWosp6; 从美国德克萨斯州两性生殖型稻水象甲成虫体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp3和ISWosp5。碱基序列比对显示: ISWosp3和ISWosp4属于IS3家族IS3组成员, ISWosp5为IS4家族IS231组成员, ISWosp6为IS5家族IS1031组成员。对这些IS的ORF结构、 所编码氨基酸序列的结构等进行了分析, 推测ISWosp5具有潜在转座活性。所得结果增进了我们对Wolbachia IS3, IS4和IS5家族插入序列的认识, 同时为今后从IS的角度探讨Wolbachia与稻水象甲生殖的关系奠定了基础。     

小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体α亚基cDNA的克隆、序列分析与不同发育阶段表达分析

烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)介导昆虫中枢神经系统中胆碱能突触兴奋性神经递质的快速传递,也是新烟碱类杀虫剂和多杀菌素的作用靶标。本研究利用RT-PCR和RACE技术,克隆了小菜蛾Plutella xylostella nAChR α亚基的一个新基因(Pxα8)的全长cDNA(GenBank登录号为EU914853)。Pxα8的cDNA序列全长1 744 bp,开放阅读框为1 602 bp,编码534个氨基酸,具有nAChR α亚基的典型特征,与其他昆虫nAChR α8亚基具有77%～96%的相似性,与果蝇nAChR β2亚基具有76%的相似性。Pxα8的开放阅读框存在单核苷酸多态性位点,导致多个位点氨基酸的替换。雌性4龄幼虫的多态性位点多于雄性4龄幼虫,而且雌、雄4龄幼虫的多态性位点均不相同。半定量RT-PCR研究结果表明,Pxα8 mRNA在成虫期表达量高于蛹期和4龄幼虫期。本研究结果为进一步研究小菜蛾nAChR 亚基的多样性和对多杀菌素的靶标抗性机制提供重要基础。     

光滑鳖甲热休克蛋白70基因的克隆及表达

根据GenBank中发表的昆虫热休克蛋白70 (heat shock protein 70, HSP70) 基因的保守序列设计引物,利用PCR结合RACE扩增的方法,获得新疆荒漠昆虫光滑鳖甲Anatolica polita borealis热休克蛋白70基因,命名为APhsp70 (GenBank注册号为EF569673)。测序结果表明,序列长为2 092 bp,由核酸序列推演出的蛋白质分子量为70 kD,含653个氨基酸残基。基因结构分析表明APhsp70不含内含子序列。通过Northern blotting和半定量RT-PCR技术研究昆虫在受到不同温度胁迫时该基因的表达规律,结果表明：在45℃处理时,昆虫体内该基因的表达水平显著上升。并且,当机体受到-5℃低温胁迫并在室温恢复15 min后APhsp70的表达量也显著升高;但是4℃和-10℃低温处理组APhsp70的表达未见明显变化。     

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE 技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4（GenBank 登录号为EU977182）。该基因全长2 182 bp,包含1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9 kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激（4℃）和热激（40℃）1 h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。     

光肩星天牛体内纤维素酶活性及其与寄主选择的关系（英文）

为了揭示光肩星天牛Anoplophora glabripennis Motschulsky纤维素酶与寄主选择的关系, 以4种不同寄主树种（新疆杨Populus alba var. pyramidalis Bunge、箭杆杨Populus nigra var. thevestina (Dode) Bean、合作杨Populus simonii × Populus pyramidalis cv. opera Hsu和漳河柳Salix matsudana f. lobato-glandulosa Faug et Liu来源的光肩星天牛幼虫, 和以取食5种不同树种（臭椿Ailanthus altissima、毛白杨Populus tomentosa、合作杨、旱柳Salix matsudana Koidz.和复叶槭Acer negundo Linn.）的光肩星天牛成虫为实验对象, 测定其纤维素酶活性。结果表明: 不同寄主来源的光肩星天牛幼虫内切-β-1,4-葡聚糖酶活性在1.36~2.71 μmol葡萄糖/ (g FW·h)之间, β-葡萄糖苷酶活性在2.57~4.86 μmol葡萄糖/(g FW·h)之间;取食不同树种的光肩星天牛成虫内切-β-1,4-葡聚糖酶活性在4.08~9.27 μmol葡萄糖/(g FW·h)之间, β-葡萄糖苷酶活性在2.87~6.08 μmol葡萄糖/ (g FW·h)之间。不同寄主树种来源的光肩星天牛幼虫体内纤维素酶活性无显著性差异, 取食与否以及取食树种的不同对光肩星天牛成虫纤维素酶活有较大影响。     

基于ITS-1基因的菜粉蝶地理种群遗传分化研究

为了探讨我国不同地区菜粉蝶种群之间的遗传分化情况, 本研究运用克隆测序法, 对我国16个地区79只菜粉蝶Pieris rapae rDNA的ITS-1基因序列进行测定并分析; 同时, 以东方菜粉蝶Pieris canidia为外群, 重建了它们的系统发生树, 初步探讨了它们的生物地理学分化格局。序列分析结果显示: 所测菜粉蝶的ITS-1序列长度介于337~458 bp之间。经序列比对后, 在347个位点中共有281个保守位点, 63个变异位点, 16个简约信息位点和47个单突变位点; AMOVA软件分析其核苷酸多态性指数(nucleotide diversity) Pi为0.014, 每位点Theta (per site) Eta为0.041, 遗传分化指数(F_ST)为0.351 (P<0.05); DnaSP软件共检测出48个单倍型(haplotype)序列, 单倍型多样性(haplotype diversity)的频率为0.989。系统发生分析结果表明: 现存的菜粉蝶各地理种群与其地理分布没有直接的对应关系根据系统发生树结果推测, 该蝶种在我国的最早建群可能发生于辽宁、内蒙古及北京一带, 其后, 通过幼虫寄主植物的水陆运输以及成虫的迁飞向我国的不同地区扩散。     

中国菲寄蝇属分类研究(双翅目: 寄蝇科)

经研究发现中国菲寄蝇属现共有9种,其中包括4新种：金额菲寄蝇Phebellia aurifrons sp. nov.,褐粉菲寄蝇Ph. fulvipollinis sp. nov.,宽叶菲寄蝇Ph. latisurstyla sp. nov.和毛基节菲寄蝇Ph. setocoxa sp. nov.。我国新记录3种：叶蜂菲寄蝇Ph. clavellariae (Brauer & Bergenstamm),灰粉菲寄蝇Ph. glauca (Meigen)和拟灰粉菲寄蝇Ph. glaucoides Herting。本文除详细描述新种特征及绘制特征图外,还提供中国菲寄蝇属已知种类的分种检索表。     

铃刺蛾属在中国的首次发现及七新种记述（鳞翅目：刺蛾科）

首次报道铃刺蛾属Kitanola Matsumura及环铃刺蛾K. uncula (Staudinger)在中国有分布,并记述7新种,即针铃刺蛾K. spina sp. nov.,小针铃刺蛾K. spinula sp. nov.,线铃刺蛾K. linea sp. nov.,灰白铃刺蛾K. albigrisea sp. nov.,蔡氏铃刺蛾K. caii sp. nov.,短颚铃刺蛾K. brachygnatha sp. nov.和宽颚铃刺蛾K. eurygnatha sp. nov.。编制了本属中国已知种的检索表,提供了成虫彩色照片和外生殖器特征图。新种模式标本均保存在中国科学院动物研究所。     

中国副蟑跳小蜂属分类研究及两新种记述（膜翅目：跳小蜂科）

记述了分布于中国的副蟑跳小蜂属Parablatticida的6 种,其中有2 新种：P. orientalis sp. nov.和P. scapata sp. nov.;P. brevicornis (Dalman),P. magniclava Hayat和 P. terebrata (Trjapitzin) 为中国新记录种。文中提供了分种检索表、形态特征图。模式标本及其他研究标本保存在中国科学院动物研究所动物标本馆。