棉铃虫性染色体两种分子标记的克隆及序列分析

为了建立棉铃虫Helicoverpa armigera性染色体的特异性分子标记,利用RAPD-PCR技术对雌雄棉铃虫基因组DNA进行筛选,从500种随机引物中筛选到1 条引物（Operon编号为AF-18）,可扩增出1条约450 bp 的雌性特异片段。经克隆测序并合成特异引物进行验证,表明该片段为棉铃虫雌性特异分子标记,位于W染色体上。利用家蚕、果蝇等昆虫Kettin基因序列,克隆了棉铃虫的同源基因HaKettin片段,并采用荧光定量PCR技术,以棉铃虫的DH-PBAN基因为参照基因,检测棉铃虫雌雄不同个体间HaKettin基因与DH-PBAN基因的拷贝数之比,结果表明：雄体HaKettin∶DH-PBAN=1.0,雌体HaKettin∶DH-PBAN=0.5,据此推断HaKettin基因位于棉铃虫Z染色体上。     

四种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞(Bm-e-HNU5)内的瞬时表达

以红色荧光蛋白基因（RFP）为报告基因,构建含4种不同启动子的重组表达质粒,用脂质体介导法转染家蚕Bombyx mori细胞（Bm-e-HNU5）,观察家蚕细胞质肌动蛋白4基因启动子（A4）、α微管蛋白基因启动子（α-tub）、蚕丝心蛋白重链基因启动子（Fib）和家蚕核型多角体病毒早期即刻蛋白基因启动子（IE）4种启动子调控RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达情况。构建的重组表达质粒pDsRed-α-tub、pDsRed-A4、pDsRed-IE和pDsRed-Fib经双酶切和PCR鉴定正确无误。转染和转录实验结果表明,除了pDsRed-A4外,其他3种重组质粒在Bm-e-HNU5细胞中都得到高转染率,α-tub、IE和Fib可依次增强RFP报告基因在家蚕细胞内的瞬时表达活性。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

蛋白质组学技术的发展及其在昆虫中的应用

蛋白质组学在模式昆虫中的应用随着这些模式昆虫全基因序列先后完成而相继展开。蛋白组学作为一门有效而直观的研究整体蛋白质的方法,在非模式昆虫中应用也非常广泛。蛋白质组学在模式昆虫中主要应用于黑腹果蝇Drosophila melanogaster、家蚕Bombyx mori、冈比亚按蚊Anopheles gambiae、意大利蜜蜂Apis mellifera中;在非模式昆虫中主要应用在各种昆虫的生理、药剂毒理和化学生态学研究中。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

感染稻水象甲的Wolbachia基因组中插入序列的鉴定与分析

共生细菌Wolbachia对宿主的生殖起多种调控作用。以往研究表明, Wolbachia基因组中广泛存在插入序列(insertion sequence, IS), 它们对宿主基因组的可塑性、 多样性和进化起重要作用。稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel在东亚是一种外来水稻害虫, 在原产地北美营两性生殖, 而在所有入侵地均营孤雌生殖。本研究采用PCR法从河北唐海孤雌生殖型稻水象甲体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp4和ISWosp6; 从美国德克萨斯州两性生殖型稻水象甲成虫体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp3和ISWosp5。碱基序列比对显示: ISWosp3和ISWosp4属于IS3家族IS3组成员, ISWosp5为IS4家族IS231组成员, ISWosp6为IS5家族IS1031组成员。对这些IS的ORF结构、 所编码氨基酸序列的结构等进行了分析, 推测ISWosp5具有潜在转座活性。所得结果增进了我们对Wolbachia IS3, IS4和IS5家族插入序列的认识, 同时为今后从IS的角度探讨Wolbachia与稻水象甲生殖的关系奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌Rpp02菌株cry1Ac20基因的克隆及表达

Rpp02菌株是本实验室分离的一株对鳞翅目等多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni), 经PCR检测,它含有cry1Ac基因。对其基因组DNA进行PCR扩增,得到大约4 kb的产物。测序结果表明,该片段含有一个较大的ORF框,基因编码区为3 534 bp,编码1 177个氨基酸,分子量为133.144 kD,pI 4.952, 为弱酸性蛋白质,亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）3种氨基酸含量最高,分别为8.0%、7.8%、7.7%。该基因序列与cry1Ac序列同源性达到99%,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ac20。生物测定表明,该基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有较强的杀虫效果,试喂菜青虫48 h后,校正死亡率为88.78%。     

棉铃虫P450基因CYP9A12酵母表达产物对拟除虫菊酯的代谢作用

细胞色素P450氧化酶解毒代谢作用增强是棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的主要原因,棉铃虫细胞色素P450氧化酶基因CYP9A12的组成型过量表达与拟除虫菊酯抗性相关。为了进一步明确棉铃虫细胞色素P450氧化酶基因CYP9A12与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的关系,采用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae表达系统异源表达了CYP9A12基因,检测了该基因的酵母表达产物对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯4种药剂的离体代谢作用。结果表明：含有CYP9A12外源基因的重组酵母细胞裂解液对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯的代谢率分别为8.58,5.85和3.94 pmol/min·mg protein,而没有检测到对甲氰菊酯的代谢。本研究表明了CYP9A12具有代谢多种拟除虫菊酯的能力,也为CYP9A12参与拟除虫菊酯的解毒代谢提供了直接证据。     

香港潜蝇科(双翅目)的分类研究

报道了香港22种潜蝇科昆虫,其中包括5新种、6个中国大陆新记录种。新种模式标本分藏于下列两处： Melanagromyza squamifera sp. nov., Ophiomyia imparispina sp. nov., Phytomyza redunca sp. nov.的模式标本保存于日本东京自然博物馆; Melanagromyza dipetala sp. nov., Ophiomyia vasta sp. nov.的模式标本保存于美国夏威夷比肖普博物馆。     

斜纹夜蛾两个天蚕素D基因的克隆及序列分析

天蚕素是昆虫抵御病菌入侵的一类抗菌肽家族。根据斜纹夜蛾Spodoptera litura天蚕素B基因设计特异引物,通过PCR扩增得到2个新的天蚕素基因部分序列,分别命名为cecD1和cecD2（GenBank登录号分别为EF555567和EF555568）。2个基因编码同一个天蚕素D蛋白,该蛋白的成熟肽与天蚕素B存在2个氨基酸残基差异。序列分析发现cecD1和cecD2中分别包含568 bp和377 bp的内含子序列,它们有相同的5′和3′拼接位点,A+T含量分别为59.7%和69.8%,符合大多数真核生物内含子高A+T含量的特征。     

Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru

To construct the Bac-to-Bac expression system of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus(BmNPV),a transfer vector was constructed which contained an Escherichia coli(E.coli)mini-F replicon and a lacZ:attTN7:lacZ cassette within the upstream and downstream regions of the BmNPV polyhedrin gene.B.mori larvae were cotransfected with wild-type BmNPV genomic DNA and the transfer vector through subcutaneous injection to generate recombinant viruses by homologous recombination in vivo.The genomic DNA of budded viruses extracted from the hemolymph of the transfected larvae was used to transform E.coli DH10B.Recombinant bacmids were screened by kanamycin resistance,PCR and restriction enzyme(REN)digestion.One of the bacmid colonies,BmBacJS13,which had similar REN profiles to that of wild-type BmNPV,was selected for further research.To investigate the infectivity of BmBacJS13,the polyhedrin gene was introduced into the bacmid and the resultant recombinant(BmBacJS13-ph)was transfected to BmN cells.The budded viruses were collected from the supernatant of the transfected cells and used for infecting BmN cells.Growth curve analysis indicated that BmBacJS13-ph had a similar growth curve to that of wild-type BmNPV.Bio-assays indicated that BmBacJS13-ph was also infectious to B.mori larvae.     

Construction of the Bac-to-Bac System of Bombyx mori Nucleopolyhedroviru

To construct the Bac-to-Bac expression system of Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV), a transfer vector was constructed which contained an Escherichia coli (E. coli) mini-F replicon and a lacZ: attTN7: lacZ cassette within the upstream and downstream regions of the BmNPV polyhedrin gene. B. mori larvae were cotransfected with wild-type BmNPV genomic DNA and the transfer vector through subcutaneous injection to generate recombinant viruses by homologous recombination in vivo. The genomic DNA of budded viruses extracted from the hemolymph of the transfected larvae was used to transform E. coli DH10B. Recombinant bacmids were screened by kanamycin resistance, PCR and restriction enzyme (REN) digestion. One of the bacmid colonies, BmBacJS13, which had similar REN profiles to that of wild-type BmNPV, was selected for further research. To investigate the infectivity of BmBacJS13, the polyhedrin gene was introduced into the bacmid and the resultant recombinant (BmBacJS13-ph) was transfected to BmN cells. The budded viruses were collected from the supernatant of the transfected cells and used for infecting BmN cells. Growth curve analysis indicated that BmBacJS13-ph had a similar growth curve to that of wild-type BmNPV. Bio-assays indicated that BmBacJS13-ph was also infectious to B. mori larvae.     

家蚕核型多角体病毒基因polh的诱变分析

曾报道经化学诱变剂ＭＭＣ、９－ＡＡ和ＥＭＳ诱变的家蚕核型多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）多角体形态出现异常,继代分离的诱变ＢｍＮＰＶ基因组对ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ和ＢａｍＨＩ的酶切谱发生变化。研究进一步揭示,诱变ＢｍＮＰＶ的多角体外层蛋白晶格排列呈现紊乱;多角体蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳谱与对照组比较有显著差异;对多角体蛋白基因ｐｏｌｈ的测序结果显示,３组诱变ＢｍＮＰＶ的ｐｏｌｈ基因发生了多处碱基（氨基酸     

pH对红褐斑腿蝗中肠主要蛋白酶活性的影响

为评价pH对红褐斑腿蝗Catantops pinguis (Stål)中肠蛋白酶活性的影响, 本文用3种专性底物测定了不同pH环境下蝗虫中肠类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的活性。结果表明: 雄性红褐斑腿蝗中肠肠液的pH值为6.92±0.043, 雌性为7.03±0.054, 两性间差异不显著（P>0.05）。并且发现3种蛋白酶的最适pH值各不相同, 其中雌雄虫的强碱性类胰蛋白酶（以BAPNA为底物）最适pH分别为8.5和10.5; 雌雄虫的弱碱性类胰蛋白酶（以TAME为底物）最适pH分别为9.0和9.5; 而雌雄虫的类胰凝乳蛋白酶（以BTEE为底物）最适pH雌性为8.5, 雄性为8.0。统计结果显示, pH对红褐斑腿蝗中肠蛋白酶活性影响显著（P<0.01）, 两性间蛋白酶活性差异显著（P<0.01）。在最适pH情况下, 雌性的类胰蛋白酶活性高于雄性, 而类胰凝乳蛋白酶活性则是雄性高于雌性。在中肠pH范围内雌性比雄性具有更高的消化蛋白酶活性, 显示雌性具有较强的食物处理能力以摄取更多的营养物质为繁殖活动（孕卵）作准备, 而该种蝗虫最适pH范围较宽, 可能与其取食植物范围较宽有关。     

家蚕hsp20.4启动子克隆及其驱动表达产物EGT对家蚕蛹体发育的影响

为验证家蚕Bombyx mori热休克蛋白基因hsp20.4启动子的活性以及家蚕核多角体病毒egt的表达产物对家蚕发育的影响, 本实验通过PCR扩增分别得到hsp20.4启动子片段和egt片段。利用hsp20.4的启动子和红色荧光蛋白报告基因DsRed构建重组载体, 在家蚕BmN细胞以及家蚕组织中得到了瞬时表达, 表明所克隆的hsp20.4启动子序列具有热休克蛋白基因的启动子活性。又利用hsp20.4启动子和家蚕核多角体病毒的egt构建重组载体, 通过注射到蚕蛹中进行瞬时表达, 以检测egt表达产物对家蚕发育的影响, 经42℃ 1 h热诱导后, hsp20.4启动子控制的egt表达产物可以延迟家蚕发育。     

Cloning and partial characterization of a gene in Bombyx mori homologous to a human adiponectin receptor

In this study, we report the cloning and characteristics of an adiponectin-like receptor gene from Bombyx mori (BmAdipoR) with highly conserved deduced amino-acid sequences and similar structure to the human adiponectin receptor (AdipoR). Structural analysis of the translated cDNA suggested it encoded a membrane protein with seven transmembrane domains. BmAdipoR was found to be expressed in multiple tissues and highly expressed in Malpighian tubules, fat body and testis. BmNPV (Bombyx mori nucleopolyhedrovirus) bacmid system combined with confocal microscopy revealed that BmAdipoR was targeted to the cell membrane. We also found that infection with BmNPV did not have an effect on BmAdipoR mRNA quantity in the midgut of susceptible Bombyx mori strain (306) at 48 h, but BmAdipoR mRNA quantity increased significantly at 72 h. We concluded that BmAdipoR gene was a membrane protein ubiquitously expressed in Bombyx mori tissues and that its expression was altered by treating with BmNPV.     

家蚕生物反应器的研究进展及开发前景

目前,家蚕生物反应器的研究和开发主要是以BmNPV为载体,在家蚕体液中表达多种有用蛋白,其表达量比其它生化微生物高出许多倍;但是家蚕绢丝腺细胞表达外源蛋白比家蚕BmNPV表达系统有着更大的优越性。本文综述了家蚕BmNPV表达系统的研究现状及家蚕丝腺反应器表达外源基因的开发前景。     

家蚕瘫痪肽结合蛋白基因克隆与分析

ENF肽家族具有保守的N末端结构（Glu—Asn—Phe-）。该家族成员肽大多具有重叠功能活性,在鳞翅目昆虫的免疫反应,生长调控和自体调节等方面都发挥着重要的作用。在昆虫的免疫反应中,血细胞尤其是淋巴液的黏附性是针对外来侵入物的免疫应答过程中的重要因素。家蚕瘫痪肽（paralytic peptide）是ENF肽家族的一种,其具有多种的生物学活性,包括致瘫痪性及在家蚕血细胞免疫反应中的促吞噬细胞扩散活性。ENF肽家族的另一成员,粘虫（Pseudaletia separata）的生长阻抑肽（Growth-blocking peptide）,同家蚕瘫痪肽一样能够在粘虫的血细胞免疫反应中起到调节吞噬细胞的功能。目前,关于昆虫细胞免疫应答的终端调控分子机制的研究还比较少,有文献报道粘虫的生长阻抑肽结合蛋白（GBP—BP）能够起到沉默生长阻抑肽活性的功能,从而可能参与调节细胞免疫应答的终端调控。在本研究中,利用荧光差异显示技术（FDD）分析了家蚕感染BmNPV病毒后基因表达差异情况,在血淋巴中获得了一条差异条带G12782＊通过5＇-RACE技术,首次在家蚕中克隆得到了该基因的全长cDNA序列。通过同源性分析得知,该基因所编码的蛋白质与粘虫的生长阻抑肽结合蛋白具有很大的同源性,并被命名为家蚕瘫痪肽结合蛋白（Bmori paralytic peptide binding protein,PP-BP）。通过RT-PCR研究发现,该蛋白基因在血淋巴中大量表达。同时,利用实时荧光定量PCR（Real-time quantitative PCR）技术分析了该基因在正常饲养家蚕与添食BmNPV病毒的家蚕中的表达差异,结果显示该基因在家蚕添食BmNPV病毒后的表达量大大增强,这就暗示该基因可能与BmNPV病毒刺激后所引起的家蚕血液细胞免疫反应相关。利用生物信息学方法对该基因的结构进行了分析,发现该基因具有两个外显子和一个内含子。这个基因已经登入GenBank数据库,收入号为DQ306881。     

A lipase isolated from the silkworm Bombyx mori shows antiviral activity against nucleopolyhedrovirus

A protein showing strong antiviral activity against Bombyx mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) was purified from the digestive juice of B. mori larvae. A homology search of the deduced amino acid sequence of the protein cDNA revealed 56% homology with Drosophila melanogaster lipase and 21% homology with human lipase. As lipase activity of the protein was confirmed in vitro, this protein was designated Bmlipase-1. Northern blot analysis showed that the Bmlipase-1 gene is expressed in the midgut but not in other tissues, nor is it activated by BmNPV infection. In addition, the Bmlipase-1 gene was shown not to be expressed in the molting and wandering stages, indicating that the gene is hormonally regulated. Our results suggest that an insect digestive enzyme has potential as a physiological barrier against BmNPV at the initial site of viral infection.