米蛾体内Wolbachia的wsp基因序列测定与系统发育分析

Wolbachia是广泛分布于节肢动物体内的一类共生菌, 它们参与多种调控寄主的生殖活动机制。通过对wsp基因的特异性扩增和测序,发现了Wolbachia在米蛾Corcyra cephalonica (Stainton)体内的感染。利用所测序列和其他已发表的序列建立系统树,结果表明米蛾体内Wolbachia属于B大组的Pip类群,与其寄生物茧蜂及赤眼蜂中的Wolbachia各株系遗传距离相差较远。据此推测米蛾体内感染的Wolbachia不是由寄生物（茧蜂、赤眼蜂）水平传播所致。     

Wolbachia感染对拟澳洲赤眼蜂寿命、生殖力和嗅觉反应的影响

研究了通过共享同一寄主卵,短管赤眼蜂Trichogramma pretiosum体内共生的Wolbachia被水平传递到拟澳洲赤眼蜂T. confusum体内后,Wolbachia对新宿主拟澳洲赤眼蜂的影响。结果表明： Wolbachia的侵染能使拟澳洲赤眼蜂进行不完全的产雌孤雌生殖,增加拟澳洲赤眼蜂子代雌性比例,但却导致了雌蜂寿命缩短和繁殖力降低的生理损失。Wolbachia感染的当代处女蜂及其建立的种群连续5代(F₁～F₅),其子代雌蜂百分率分别为79.17%、76.60%、68.66%、72.58%、68.15%和64.06%,基本上呈现出逐代降低的趋势,并越来越接近对照的63.85%。处女蜂及F₁～F₅代雌蜂的平均寿命分别为4.33、5.50、5.60、6.68、7.32和7.50天,而未感染交配雌蜂寿命为7.59 天;处女蜂及F₁～F₅代雌蜂平均产卵量分别为11.33、70.00、86.41、93.90、102.92和124.38粒/雌,除F₅代外,均显著低于未感染交配雌蜂的产卵量134.81粒/雌。用四臂嗅觉仪测定了Wolbachia新宿主拟澳洲赤眼蜂对寄主小菜蛾的嗅觉反应,结果表明Wolbachia的侵染具轻微干扰拟澳洲赤眼蜂嗅觉反应的负面影响。未感染Wolbachia的拟澳洲赤眼蜂及Wolbachia供体短管赤眼蜂对寄主小菜蛾具较强的嗅觉反应,其雌蜂在小菜蛾腹部鳞片正己烷提取液和小菜蛾卵表正己烷提取液处理区内滞留时间显著或极显著长于对照区。而感染Wolbachia的拟澳洲赤眼蜂F₂代和F₃代雌蜂,尽管在小菜蛾腹部鳞片正己烷提取液处理区内滞留时间比对照区长,但没有达到显著水平;其F₂代雌蜂在小菜蛾卵表正己烷提取液处理区内滞留时间与对照区相比,也没有达到显著水平。随Wolbachia在拟澳洲赤眼蜂种群中垂直感染代数的增加,拟澳洲赤眼蜂对寄主小菜蛾的嗅觉反应恢复正常,在Wolbachia感染后的 F₄～F₆代,雌蜂在两种提取液处理区内的滞留时间均显著或极显著长于对照区。     

灰飞虱体内WO噬菌体和Wolbachia的侵染关系

WO噬菌体是侵染节肢动物体内感染的Wolbachia的细菌病毒, 人们推测WO噬菌体可能参与了寄主遗传变异的过程。我们对采自中国境内4个地理种群（上海闵行、 云南普洱、 山东济宁和宁夏青铜峡）的灰飞虱Laodelphax striatellus 1~2龄若虫用抗生素HCl-tetracycline处理过的水稻饲养, 每隔20 d取样测定并比较其体内Wolbachia和WO噬菌体的感染率, 以此来初步研究灰飞虱体内WO噬菌体与Wolbachia的侵染关系, 结果表明: WO噬菌体感染率的变化趋势与其宿主Wolbachia的基本一致, 都随着时间推移逐步下降。我们进一步对未经HCl-tetracycline处理的灰飞虱, 用实时定量PCR的方法对WO噬菌体和Wolbachia在不同日龄灰飞虱雌虫体内的菌量进行测定, 结果显示, 二者菌量都随着日龄的增长有所变化, 在第8天达到最大, 二者的变化趋势基本一致。由此我们推断WO噬菌体是侵染胞内共生菌Wolbachia的专性病毒, 并且感染Wolbachia的WO噬菌体很可能是溶原性的噬菌体。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

斜纹夜蛾两个天蚕素D基因的克隆及序列分析

天蚕素是昆虫抵御病菌入侵的一类抗菌肽家族。根据斜纹夜蛾Spodoptera litura天蚕素B基因设计特异引物,通过PCR扩增得到2个新的天蚕素基因部分序列,分别命名为cecD1和cecD2（GenBank登录号分别为EF555567和EF555568）。2个基因编码同一个天蚕素D蛋白,该蛋白的成熟肽与天蚕素B存在2个氨基酸残基差异。序列分析发现cecD1和cecD2中分别包含568 bp和377 bp的内含子序列,它们有相同的5′和3′拼接位点,A+T含量分别为59.7%和69.8%,符合大多数真核生物内含子高A+T含量的特征。     

谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆、序列分析及表达量检测

β-actin是actin家族的一员,在维持细胞结构、运动和分裂等细胞生理活动方面发挥着重要作用,是基因定量实验中最常用的内参之一。本实验采用同源克隆和RACE技术扩增得到谢氏宽漠王Mantichorula semenowi β-actin基因。序列分析结果表明,该基因cDNA全长1 372 bp,开放阅读框长1 131 bp,编码376个氨基酸,5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66 bp和175 bp;该序列与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异。表明β-actin是研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平的可靠内参基因。     

共生菌Cardinium对朱砂叶螨的生殖调控作用

为了了解共生菌Cardinium对朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus (Boisduval)的生殖调控作用,从检测到感染Cardinium的种群中选取山西运城和甘肃兰州2个感染率较高的种群作为实验材料,对Cardinium在寄主生殖调控方面的作用进行研究。通过人工培养100%感染Cardinium的种群和100%不感染的种群,并从中挑取不同感染类型的雌雄螨单独进行杂交实验,设立感染Cardinium(♀)×感染Cardinium(♂),感染Cardinium(♀)×不感染(♂),不感染(♀)×感染Cardinium(♂),不感染(♀)×不感染(♂) 4种杂交组合。结果发现,抗生素处理后不感染的雌螨和受感染雄螨的交配表现出了单向的胞质不亲和,而且2个种群表现出了2种类型：在山西种群不亲和的组合中,CI表现为卵孵化率显著降低,多数雌螨都产生出F₁雌螨后代,但是F₁代雌螨数量相对于其他3种组合明显减少; 而在甘肃种群不亲和的组合中则表现为卵全部孵化且幼螨100%存活,但全部为雄螨后代。2个种群中Cardinium的亲缘关系非常相近,而它们却能够在不同的地理种群中表现出不同的CI表型,这提示亲缘关系非常接近的品系也可以产生不同的表型。研究结果为深入揭示Cardinium的感染机制和生殖调控作用提供重要基础。     

香港潜蝇科(双翅目)的分类研究

报道了香港22种潜蝇科昆虫,其中包括5新种、6个中国大陆新记录种。新种模式标本分藏于下列两处： Melanagromyza squamifera sp. nov., Ophiomyia imparispina sp. nov., Phytomyza redunca sp. nov.的模式标本保存于日本东京自然博物馆; Melanagromyza dipetala sp. nov., Ophiomyia vasta sp. nov.的模式标本保存于美国夏威夷比肖普博物馆。     

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1 569 bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1 590 bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得) 6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明：CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。     

朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因TCHSP70-4的克隆与表达

为了研究朱砂叶螨Tetranychus cinnabarinus(Boisduval)热激蛋白HSP70的表达与其适应高温和低温胁迫的关系,我们利用物种的同源性及RACE 技术,获得朱砂叶螨热激蛋白HSP70基因1个,命名为TCHSP70-4（GenBank 登录号为EU977182）。该基因全长2 182 bp,包含1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,理论分子量为70.9 kDa,等电点为5.4,含有HSP70家族高度保守的基序。运用real-time PCR分析冷激（4℃）和热激（40℃）1 h后TCHSP70-4在朱砂叶螨体内的表达量。结果显示冷激后TCHSP70-4表达量明显下降,而热激后TCHSP70-4表达量却明显上升。这些结果一方面表明该基因属于诱导型HSP70基因,另一方面揭示了朱砂叶螨分别受到冷和热胁迫后体内TCHSP70-4的表达及所起的保护作用是不同的。     

中国部分地区柑桔木虱体内感染Wolbachia的检测及其系统发育分析

Wolbachia是一种广泛分布于节肢动物体内的共生细菌, 该共生菌经寄主卵的细胞质传播并参与多种寄主生殖活动调控, 对节肢动物的物种进化有着重要意义并可能应用于害虫的生物防治。本研究以柑桔黄龙病（Huanglongbing, HLB）的主要传播媒介——柑桔木虱Diaphorina citri为研究对象, 通过Wolbachia的16S rDNA、 细胞分裂基因（ftsZ）、 表面蛋白基因（wsp）的特异引物对来自于中国广西北海、 广西柳州、 广东深圳、 广东阳春、 福建福州5个地区的柑桔木虱进行PCR扩增, 并对扩增产物进行克隆测序, 与GenBank中相关序列进行比对分析, 建立了柑桔木虱共生Wolbachia的系统发育树。结果显示上述5个地区的柑桔木虱均存在Wolbachia感染, 通过Wolbachia的16S rDNA, ftsZ基因和wsp基因DNA序列的系统发育分析表明, 5个地区的柑桔木虱体内的Wolbachia均属于B组; 基于wsp基因的系统发育分析进一步表明5个地区的亚洲柑桔木虱体内的Wolbachia属于B组的Con亚组, 且不同地区柑桔木虱体内的Wolbachia的16S rDNA, ftsZ基因和wsp基因序列差异不明显。研究结果为认识柑桔黄龙病传播媒介昆虫的进化及其综合防治提供了重要的参考依据。     

水稻褐飞虱内生共生细菌Arsenophonus的鉴定和系统分析

利用16S rDNA通用引物扩增了水稻褐飞虱Nilaparvata lugens（Stål）体内共生细菌的序列,经克隆、测序和NCBI数据库比对,发现褐飞虱体内存在杀雄菌属Arsenophonus类共生细菌,系统发育上与粉虱科和木虱科体内的Arsenophonus属亲源关系较近。在褐飞虱体内该共生细菌具有两种长度不同的16S rDNA序列,分别为1 504 bp和547 bp,其中后者为前者中间缺失了957 bp,其余序列相同。通过重新设计两对引物进行扩增,进一步确认不同褐飞虱地理种群及寄主种群均存在两种片段。Arsenophonus特异的 23S rDNA引物的扩增结果表明,Arsenophonus存在于所有检测的褐飞虱种群中,但不存在于水稻寄主中。荧光定量PCR检测发现3个褐飞虱室内寄主种群Arsenophonus属共生细菌含量不同,其中TN1种群明显高于Mudgo种群和ASD7种群。此为水稻褐飞虱体内存在Arsenophonus属共生细菌的首次报道。     

亮叶中南鱼藤的杀虫活性及有效成分

研究了亮叶中南鱼藤Derris fordii var. lucida的杀虫活性及有效成分。通过生物测定确定了该植物提取物对几种害虫的杀虫活性及其作用方式,并在活性跟踪的基础上,通过萃取、柱层析、薄层制备、重结晶、核磁共振和质谱等方法对其有效成分进行了分离和鉴定。结果表明,亮叶中南鱼藤不同部位甲醇提取物中仅根部提取物表现出杀虫活性。根甲醇提取物对白纹伊蚊Aedes albopictus 4龄幼虫、棉蚜Aphis gossypii Glover 无翅成蚜、豆蚜Aphis craccivora Koch无翅成蚜、桃蚜Myzus persicae (Sulzer)无翅成蚜、甘薯天蛾Herse convolvuli L. 2龄幼虫、三化螟Scirpophaga incertulas (Walker)初孵幼虫、菜青虫Pieris rapae (L.) 2龄幼虫和黄曲条跳甲Phyllotreta striolata (Fabricius)成虫都有毒杀效果,其LC₅₀值分别是260.3 mg/L、234.6 mg/L、141.3 mg/L、16.4 mg/L、233.4 mg/L、20.8 mg/L、11.7 mg/L和148.4 mg/L。根甲醇提取物对甘薯天蛾3龄幼虫24 h的触杀和胃毒毒力LC₅₀值分别为101.6 mg/L和234.9 mg/L。此外,亚致死剂量的根甲醇提取物对甘薯天蛾3龄幼虫还有拒食和抑制生长发育的作用。从根中分离和鉴定了3个化合物,即鱼藤酮、6a,12a-脱氢鱼藤素和β-谷甾醇。鱼藤酮和6a,12a-脱氢鱼藤素对三化螟初孵幼虫表现出毒杀活性,24 h的LC₅₀值分别是2.6 mg/L和5.3 mg/L。结论为：亮叶中南鱼藤仅根为活性部位,该甲醇提取物对棉蚜等多种害虫有活性,其主要作用方式为触杀和胃毒,鱼藤酮和6a,12a-脱氢鱼藤素是根中的主要杀虫活性成分。     

华北大黑鳃金龟两种围食膜蛋白cDNA的分子克隆与序列分析

本文以华北大黑鳃金龟Holotrichia oblita中肠为材料,依据Stratagene公司文库构建试剂盒方法,构建其中肠cDNA表达文库,该文库滴度为1.9×106 pfu/mL,重组率为99.97%。依据现代免疫学原理,利用棉铃虫Helicoverpa armigera围食膜蛋白多克隆抗体筛选文库,得到两个编码华北大黑鳃金龟围食膜蛋白的cDNA克隆Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2,其cDNA长分别为2 385 bp和1 633 bp,在PolyA末端上游各有3个多聚腺苷酸信号序列AATAAA,最长开放阅读框(ORF)分别编码729个和477个氨基酸,与粉纹夜蛾Trichoplusia ni CBP2(chitin binding protein 2)的相似性最高,分别为21.9%和19.1%。结构域分析表明,Ho-Peritrophin1与Ho-Peritrophin2分别具有9个和6个几丁质结合功能域,只含有较少的O-糖基化位点,不含有类粘蛋白结构域。胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对两种蛋白的作用位点主要位于几丁质结合功能域(chitin binding domain, CBD)内部,而因受几丁质结合功能域保护,这两种蛋白能够抵抗这些蛋白酶的降解。与正常CBD比较,这两种蛋白C端的CBD只含有4个Cys,只在第1与第3、第4与第5个Cys之间形成两对二硫键,缺少由第2与第6个Cys形成的二硫键。推测其N端还应包括信号肽序列和几丁质结合功能域的未知序列。     

两近缘种烟草上棉铃虫种群适合度的比较研究

分别在室内和自然条件下,比较研究了普通烟草和黄花烟草两种不同寄主植物上棉铃虫生长发育、食物转化和利用及种群增长情况。结果表明： (1) 室内26±1℃、75%±5% RH和16L∶8D光周期条件下,与普通烟草相比,黄花烟草上幼虫的发育历期显著延长,1龄和2龄幼虫的存活率及雌蛾产卵量显著下降,种群净增殖率（R₀=30.5374）和内禀增长率（r_m=0.0951）减小;(2) 6龄幼虫对两种烟草的近似消化率及其相对生长率无显著差异,但对黄花烟草的利用率和转化率显著下降,相对取食量显著提高;(3) 第2代棉铃虫在普通烟田的种群增长（I=1.9922>1）比黄花烟田（I=1.1581>1）快,“烟草和其他”对种群起主要控制作用,特别是对低龄幼虫;第3代棉铃虫在普通烟田的种群增长有所减慢但仍呈上升趋势（I=1.5994>1）,而在黄花烟田则呈下降趋势（I=0.6434<1）,低龄幼虫受烟草抗性和雨水等的影响较大,高龄幼虫被病菌感染的数量增多。这些结果表明,与普通烟草相比,黄花烟草不适合棉铃虫种群的增长和繁殖。     

亚洲玉米螟幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶cDNA片段的克隆与序列分析

为研究亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis (Guenée)幼虫体内酚氧化酶原激活蛋白酶（prophenoloxidase activating proteinase, PAP）表达调控的分子机理, 本研究根据不同昆虫酚氧化酶原激活蛋白酶基因序列的保守区域, 设计合成简并引物, 采用RT-PCR技术从亚洲玉米螟5龄幼虫中扩增出PAP的一段cDNA片段, 大小为509 bp, 编码169个氨基酸, 预测分子量为18.7 kD, 理论等电点(pI值)为5.1。该基因序列中含有丝氨酸蛋白酶样结构域中保守的催化三联体, 不含发夹结构域。BlastP分析结果表明: 该片段的氨基酸序列与烟草天蛾Manduca sexta PAP-3和冈比亚按蚊Anopheles gambiae发夹型蛋白B1的氨基酸序列一致性最高, 为47%; 与烟草天蛾PAP-2、家蚕Bombyx mori PPAE、 斜纹夜蛾Spodoptera litura PPAE-3、 蓖麻蚕Samia cynthia ricini PAP和黑腹果蝇Drosophila melanogaster丝氨酸蛋白酶7的氨基酸序列的一致性分别为45%, 45%, 44%, 43%和41%。构建系统发育树, 对其进化关系进行了初步分析, 结果显示: 亚洲玉米螟PAP与烟草天蛾PAP-3和斜纹夜蛾PPAE-3的亲缘关系较近, 与黑腹果蝇丝氨酸蛋白酶7和冈比亚按蚊发夹型蛋白B1的亲缘关系较远。这些结果说明克隆得到的cDNA片段为亚洲玉米螟幼虫PAP基因靠近羧基端的部分序列。     

转cry1Ac/sck基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落影响的评价

以转cry1Ac/sck双基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4（对照： MH86）及其杂交稻KF6-304（对照： Ⅱ-YM86）为材料,系统地研究了转基因抗虫水稻对稻田寄生蜂群落的影响及生态安全性。结果表明： 在群落水平上,转基因抗虫水稻MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304对稻田寄生蜂的物种丰富度、多样性指数、均匀性指数和优势集中性指数的总体情况与时间动态以及个体总数无明显负面影响,但在生长中期转基因稻可降低稻田寄生蜂的个体数量。按寄生蜂功能团分析,MSA与MSA4在水稻生长发育的后期初始,提高卵寄生蜂的数量,MSA、MSB、MSA4及杂交稻KF6-304显著降低以靶标害虫稻纵卷叶螟为寄主的寄生蜂功能团的个体数量,对其他寄生蜂无明显负面影响。     

大豆蚜细胞色素氧化酶Ⅱ基因的克隆及其在捕食性天敌昆虫鉴定中的应用

利用通用引物,对大豆蚜Aphis glycines Matsumura的细胞色素氧化酶Ⅱ（COⅡ）基因序列进行克隆和测序。测得的序列长度为810 bp,并与已在GenBank上登录的其他蚜虫COⅡ基因序列进行比较分析,验证其同源性,同时将该序列在GenBank进行了登记 (登录号为DQ265743)。根据此片段的碱基序列设计了1对大豆蚜特异引物,其扩增片段约为270 bp;种特异性检验结果表明,该引物只对大豆蚜具有扩增能力,对其他相关蚜虫种类不具有扩增效果;并用此引物对大豆蚜捕食性天敌进行定性检测,结果表明,在取食过大豆蚜的异色瓢虫Harmonia axyridis、龟纹瓢虫Propylaea japonica、大草蛉Chrysopa septempunctata幼虫以及小花蝽Orius similes 成虫和幼虫等捕食性昆虫的中肠中均能检测到大豆蚜的DNA片段; 而在未取食蚜虫的上述天敌中却未能扩增出来。