棉铃虫细胞色素P450 CYP6B7基因的克隆与融合表达

细胞色素P450 CYP6B7被推测与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性有关,但至今尚无CYP6B7参与杀虫剂代谢方面的直接证据。为揭示CYP6B7的代谢功能,作者以棉铃虫幼虫基因组DNA 为模板,以CYP6B7基因设计特异性引物,扩增出包含321 bp内含子的CYP6B7基因。用反向PCR的方法消除内含子,获得包含完整的CYP6B7基因的开放阅读框。将CYP6B7基因与pMAL-c2X载体连接,并转化E.coli TB1细胞,在IPTG诱导下,CYP6B7能与载体基因编码的麦芽糖结合蛋白（MBP）在大肠杆菌中融合表达,表达产物经直链淀粉（amylose） 柱亲和层析分离洗脱后,得到SDS-PAGE电泳纯的融合蛋白。     

棉铃虫P450基因CYP6AE12和CYP9A18的克隆与mRNA表达水平

采用RT-PCR和RACE技术克隆到2个新的棉铃虫细胞色素P450基因：CYP6AE12和CYP9A18。CYP6AE12的cDNA编码区长1 569 bp,编码523个氨基酸;CYP9A18的cDNA编码区长1 590 bp,编码530个氨基酸。用实时定量PCR技术分析了这2个基因在棉铃虫YS敏感品系和YS-FP抗性品系(由氰戊菊酯加辛硫磷混剂筛选YS品系而得) 6龄幼虫脂肪体和中肠中mRNA的表达水平。结果表明：CYP6AE12和CYP9A18的mRNA表达具有组织特异性,CYP6AE12在脂肪体中表达量较高,而CYP9A18在中肠中的表达量较高。与相对敏感品系YS相比,CYP6AE12在YS-FP抗性品系中肠和脂肪体中的mRNA表达量分别为YS品系的3.6倍和1.3倍;CYP9A18在YS-FP品系中肠和脂肪体的mRNA表达量分别为YS品系的0.3倍和1.0倍。CYP6AE12的过量表达与YS-FP品系棉铃虫的抗药性可能有一定关系。     

家蚕细胞色素P450基因Bmcyp6u1的克隆、序列分析与表达谱

细胞色素P450第6亚家族基因为昆虫所特有,与抗性相关。为了检测家蚕Bombyx mori cyp6u1基因是否与耐氟性相关,首先克隆了cyp6u1基因。采用生物信息学方法获得与黑腹果蝇Drosophila melanogaster cyp6u1基因同源的家蚕B. mori cyp6u1基因序列, 预测该序列的开放阅读框（ORF）为1 476 bp, 编码491个氨基酸, 推定的蛋白质分子质量为56.15 kD, 等电点为9.23。以家蚕5龄第3天幼虫精巢cDNA为模板, 设计特异引物PCR扩增出一条约1 500 bp的条带, 大小与家蚕cyp6u1序列的ORF预测值接近, 命名为Bmcyp6u1基因（GenBank登录号：HM130560）。同源性分析表明, Bmcyp6u1基因与蜜蜂Apis mellifera的同源基因cyp6AS13的相似性为56%, 与拟南芥Arabidopsis thaliana的cyp72A82的相似性为48%, 与人Homo sapiens的cyp3A7基因的相似性为50%。芯片数据分析表明, Bmcyp6u1基因在家蚕5龄第3天幼虫各组织表达量很低, 只在精巢组织(5龄第3天)稍有表达, 推测该基因具有组织特异性。     

家蚕核型多角体病毒egt基因的分子进化分析

过PCR方法获得家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrosis virus,BmNPV）的蜕皮甾体尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因（egt）片段,序列分析表明该片段带有EGT的完整ORF,推测的多肽可形成EGT结构域的高级结构。为了研究egt的起源,利用家蚕基因组数据库,电子克隆了多个家蚕尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT）基因,在此基础上进行了进化分析,表明BmNPV的EGT为antennal-enriched型UGT;推测核型多角体病毒（nucleopolyhedrivirus,NPV）和颗粒体病毒（granulovirus,GV）的egt基因在进化上来源于昆虫的UGT基因,但GV的egt基因在进化上的起源可能要早于NPV的egt基因;可能在昆虫祖先种进化形成不同昆虫目的某一时期,杆状病毒的祖先种从昆虫中获得了antennal-enriched型UGT基因,并进化为egt基因。家蚕的部分UGT基因与转座子元件连锁的基因组结构特点反映了杆状病毒的egt基因可能通过转座子的传递而获得。     

棉铃虫P450基因CYP9A12酵母表达产物对拟除虫菊酯的代谢作用

细胞色素P450氧化酶解毒代谢作用增强是棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性的主要原因,棉铃虫细胞色素P450氧化酶基因CYP9A12的组成型过量表达与拟除虫菊酯抗性相关。为了进一步明确棉铃虫细胞色素P450氧化酶基因CYP9A12与拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的关系,采用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae表达系统异源表达了CYP9A12基因,检测了该基因的酵母表达产物对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、甲氰菊酯和联苯菊酯4种药剂的离体代谢作用。结果表明：含有CYP9A12外源基因的重组酵母细胞裂解液对溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和联苯菊酯的代谢率分别为8.58,5.85和3.94 pmol/min·mg protein,而没有检测到对甲氰菊酯的代谢。本研究表明了CYP9A12具有代谢多种拟除虫菊酯的能力,也为CYP9A12参与拟除虫菊酯的解毒代谢提供了直接证据。     

大豆蚜细胞色素氧化酶Ⅱ基因的克隆及其在捕食性天敌昆虫鉴定中的应用

利用通用引物,对大豆蚜Aphis glycines Matsumura的细胞色素氧化酶Ⅱ（COⅡ）基因序列进行克隆和测序。测得的序列长度为810 bp,并与已在GenBank上登录的其他蚜虫COⅡ基因序列进行比较分析,验证其同源性,同时将该序列在GenBank进行了登记 (登录号为DQ265743)。根据此片段的碱基序列设计了1对大豆蚜特异引物,其扩增片段约为270 bp;种特异性检验结果表明,该引物只对大豆蚜具有扩增能力,对其他相关蚜虫种类不具有扩增效果;并用此引物对大豆蚜捕食性天敌进行定性检测,结果表明,在取食过大豆蚜的异色瓢虫Harmonia axyridis、龟纹瓢虫Propylaea japonica、大草蛉Chrysopa septempunctata幼虫以及小花蝽Orius similes 成虫和幼虫等捕食性昆虫的中肠中均能检测到大豆蚜的DNA片段; 而在未取食蚜虫的上述天敌中却未能扩增出来。     

棉铃虫嗅觉受体基因的克隆及组织特异性表达

昆虫嗅觉受体是一个高度变异的蛋白家族,但是其中一类嗅觉受体很特殊,它们在不同昆虫体内高度保守。该文作者从棉铃虫Helicoverpa armigera体内克隆得到了这类受体基因,命名为ORHarm。ORHarm编码473个氨基酸残基,序列中有7个跨膜区,是典型的G蛋白偶联的受体。ORHarm与已经报道的昆虫同类嗅觉受体的同源性在60％以上,与近缘种烟芽夜蛾Heliothis virescens嗅觉受体的同源性高达99.4％。半定量RT-PCR研究表明,ORHarm主要在棉铃虫成虫触角中表达,在喙中也有表达,但表达量较低,在成虫其他的部位不表达;在棉铃虫发育的各个时期,如卵、幼虫、蛹和成虫体内,也都有表达。ORHarm不仅在感受挥发性气味物质的过程中起着重要的作用,而且也参与液态化学刺激的识别过程。     

斜纹夜蛾两个天蚕素D基因的克隆及序列分析

天蚕素是昆虫抵御病菌入侵的一类抗菌肽家族。根据斜纹夜蛾Spodoptera litura天蚕素B基因设计特异引物,通过PCR扩增得到2个新的天蚕素基因部分序列,分别命名为cecD1和cecD2（GenBank登录号分别为EF555567和EF555568）。2个基因编码同一个天蚕素D蛋白,该蛋白的成熟肽与天蚕素B存在2个氨基酸残基差异。序列分析发现cecD1和cecD2中分别包含568 bp和377 bp的内含子序列,它们有相同的5′和3′拼接位点,A+T含量分别为59.7%和69.8%,符合大多数真核生物内含子高A+T含量的特征。     

苏云金芽孢杆菌Rpp02菌株cry1Ac20基因的克隆及表达

Rpp02菌株是本实验室分离的一株对鳞翅目等多种害虫具有高毒力的苏云金芽孢杆菌莫里逊亚种 (Bacillus thuringiensis subsp. morrisoni), 经PCR检测,它含有cry1Ac基因。对其基因组DNA进行PCR扩增,得到大约4 kb的产物。测序结果表明,该片段含有一个较大的ORF框,基因编码区为3 534 bp,编码1 177个氨基酸,分子量为133.144 kD,pI 4.952, 为弱酸性蛋白质,亮氨酸（Leu）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）3种氨基酸含量最高,分别为8.0%、7.8%、7.7%。该基因序列与cry1Ac序列同源性达到99%,并被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会命名为cry1Ac20。生物测定表明,该基因在大肠杆菌中得到了表达,表达产物具有较强的杀虫效果,试喂菜青虫48 h后,校正死亡率为88.78%。     

感染稻水象甲的Wolbachia基因组中插入序列的鉴定与分析

共生细菌Wolbachia对宿主的生殖起多种调控作用。以往研究表明, Wolbachia基因组中广泛存在插入序列(insertion sequence, IS), 它们对宿主基因组的可塑性、 多样性和进化起重要作用。稻水象甲Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel在东亚是一种外来水稻害虫, 在原产地北美营两性生殖, 而在所有入侵地均营孤雌生殖。本研究采用PCR法从河北唐海孤雌生殖型稻水象甲体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp4和ISWosp6; 从美国德克萨斯州两性生殖型稻水象甲成虫体内克隆获得了Wolbachia的2条IS序列, 即ISWosp3和ISWosp5。碱基序列比对显示: ISWosp3和ISWosp4属于IS3家族IS3组成员, ISWosp5为IS4家族IS231组成员, ISWosp6为IS5家族IS1031组成员。对这些IS的ORF结构、 所编码氨基酸序列的结构等进行了分析, 推测ISWosp5具有潜在转座活性。所得结果增进了我们对Wolbachia IS3, IS4和IS5家族插入序列的认识, 同时为今后从IS的角度探讨Wolbachia与稻水象甲生殖的关系奠定了基础。     

松毛虫DpKettin基因片段的克隆与初步定位研究

对于ZW型鳞翅目昆虫, 雄性为ZZ, 雌性为ZW; 细胞内Z染色体数与常染色体组数之比在雌雄间存在差异, 雄性为2Z∶2A=1.0, 雌性为Z∶2A=0.5, 如果某物种一个基因(假如K基因)位于Z染色体上, 另一个基因(假如N基因)位于常染色体上, 则雄体中2K∶2N=1.0, 雌体中K∶2N=0.5。研究利用家蚕、棉铃虫等昆虫Kettin基因序列, 克隆了松毛虫的同源基因(DpKettin)片段, 并采用荧光定量PCR技术, 以松毛虫的ANT基因为参照基因, 检测松毛虫雌雄不同个体间DpKettin基因与腺苷酸转移酶基因(ANT)的拷贝数之比, 结果表明: 雄体DpKettin∶ANT=1.0, 雌体DpKettin∶ANT=0.5, 说明DpKettin基因位于松毛虫Z染色体上。     

家蚕Bm Tpi基因Z染色体定位

采用实时定量PCR技术,以家蚕Bombyx mori第11号染色体上的DH-PBAN基因为参照基因,检测家蚕不同个体间Bm Tpi基因与常染色体上DH-PBAN基因的拷贝数之比,雄体Bm Tpi∶DH-PBAN=1.0,雌体Bm Tpi∶DH-PBAN=0.5;并用已经定位于Z染色体上的Bm Kettin基因为参照,检测Bm Tpi基因的拷贝数与Bm Kettin基因的拷贝数之比,雄体Bm Tpi∶Bm Kettin=1.0,雌体Bm Tpi∶Bm Kettin=1.0,证明Bm Tpi基因在家蚕基因组中的拷贝数与Bm Kettin基因相同,说明Bm Tpi基因位于Z染色体上。     

光对棉铃虫和烟青虫杂交的影响

【目的】力求建立一种准确鉴定室内棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)、烟青虫H.assulta(Guenée)及其杂交种的分子技术,探讨棉铃虫和烟青虫杂交的可能。【方法】室内暗期设置0.5 lx黑光灯和白炽灯,测定不同配对模式下3日龄处女棉铃虫和烟青虫的杂交率;筛选可区分室内建立的棉铃虫、烟青虫及杂交种家族的微卫星位点;于架设有黑光灯的温室内释放棉铃虫和烟青虫混合种群,利用微卫星分子标记技术检测子代微卫星位点大小。【结果】两种蛾类在任何一种配对模式下均可杂交,混合种群处理杂交率为2.92%,且均为烟青虫雌蛾与棉铃虫雄蛾配对交配;黑光灯、白炽灯和黑暗条件下杂交率无显著性差异;筛选出的Har SSR1、Har SSR9和Har SSR10在两种蛾类上的等位基因片段大小不一样;两年温室实验共鉴定360头子代,混合种群中未检测到杂交后代。【结论】交配笼中棉铃虫和烟青虫能进行种间杂交,弱光不能提高二者杂交率;混合种群处理只发现一种杂交配对模式,说明了棉铃虫雄蛾的交配竞争能力更强;成功利用微卫星分子标记技术鉴定室内建立的棉铃虫、烟青虫及杂种家族,提供了一种简单准确的分子鉴定手段;两年温室实验未检测到杂交种,说明2种蛾类之间存在着交配前生殖隔离机制。     

华北棉区玉米田三代棉铃虫种群动态及其对棉田发生为害的作用分析

本文通过玉米田、棉田中对棉铃虫(Heliogyis armigera)种群动态的系统调查和自然种群生命表的分析,明确了玉米田是三代棉钰虫的重要栖境。并且棉铃虫在玉米田的幼期死亡率显著高于棉田。通过棉田三代棉铃虫的影响指数分析,在9个变量中,玉米田与棉田种植面积的比值被确定为主动因素,而棉田二代棉铃虫卵量被确定为关键因素。最后通过当地1973-1991年共19年的资料对上述结果进行了检验,获得了满意的结果。     

转基因抗虫棉种植面积变化对花生田棉铃虫种群影响

【目的】棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)是花生田主要害虫之一。转基因抗虫棉全面推广后,棉铃虫种群(包括棉田、花生田、玉米田)得到有效控制。近年,随着转基因抗虫棉种植面积逐年下降,花生田棉铃虫种群呈现逐年上升趋势。【方法】本文通过调查山东省花生主产区(非棉区)龙口、招远、莱阳、文登四个县级市花生田棉铃虫成虫、卵量、幼虫量等的发生情况,分析了棉铃虫发生面积及种群数量15年(2000—2014年)的变化规律,并重点分析了主要影响因素。【结果】结果表明:花生棉铃虫发生面积受棉花种植面积影响较大,二者呈显著负相关性;花生田棉铃虫累计诱蛾量总体呈下降趋势,但与棉花种植面积相关性不显著;棉铃虫卵量、虫量与抗虫棉种植面积呈显著负相关性。【结论】所以,转基因抗虫棉种植面积减少是导致花生田棉铃虫种群数量上升的主要因素。另外,近年玉米田棉铃虫发生面积也呈逐年上升趋势,与抗虫棉种植面积呈显著负相关。所以,随转基因抗虫棉种植面积的下降,若不采取有效措施,棉铃虫种群可能会出现大发生趋势。     

新疆棉区转Bt基因棉对棉铃虫生物学的影响

棉铃虫Helicoverpaarmigera高龄幼虫取食转Bt基因棉花组织后 ,化蛹率、羽化率、蛹重、体长均有显著下降 ,在转Bt基因棉花上棉铃虫的取食行为也受到较大的影响 ,表现为取食次数明显减少、吐丝下垂次数明显增加 ;无论是转Bt基因棉花还是常规棉花 ,棉铃虫 3龄幼虫主要分布于繁殖器官上 ,在转Bt基因棉花各繁殖器官上的分布概率为 :花 >棉铃 >棉蕾 ,常规棉花上分布概率为 :棉蕾 >棉铃 >花 ;棉铃虫高龄幼虫取食转Bt基因棉花各组织 ,成虫羽化后产卵量、卵孵化率均有明显下降 ;在较低的棉铃虫虫口密度下 ,转Bt基因棉花对棉铃虫有一定的产卵排趋性。     

Transgenic cotton expressing synthesized scorpion insect toxin AaHIT gene confers enhanced resistance to cotton bollworm (Heliothis armigera) larvae

A synthetic scorpion Hector Insect Toxin (AaHIT) gene, under the control of a CaMV35S promoter, was cloned into cotton via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Southern blot analyses indicated that integration of the transgene varied from one to more than three estimated copies per genome; seven homozygous transgenic lines with one copy of the T-DNA insert were then selected by PCR and Southern blot analysis. AaHIT expression was from 0.02 to 0.43% of total soluble protein determined by western blot. These homozygous transgenic lines killed larvae of cotton bollworm (Heliothis armigera) by 44–98%. The AaHIT gene could used therefore an alternative to Bt toxin and proteinase inhibitor genes for producing transgenic cotton crops with effective control of bollworm.     

Comparative production of Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae) from transgenic cotton expressing either one or two Bacillus thuringiensis proteins with and without insecticide oversprays

Transgenic cotton, Gossypium hirsutum (L.), expressing either one or two Bacillus thuringiensis ssp. kurstaki Berliner (Bt) proteins was compared with the conventional sister line in field experiments with regard to production of bollworm, Helicoverpa zea (Boddie), and bolls damaged by bollworm. The relative numbers of bollworms that developed on Bollgard (Monsanto Co., St. Louis, MO), Bollgard II (Monsanto Co.), and conventional cotton were estimated under nontreated conditions in 2000 and both insecticide-treated and nontreated conditions in 2001-2002 in North Carolina tests. Averaged across seven field studies under nontreated conditions, Bollgard cotton generated statistically similar numbers of large (L4-L5) bollworm larvae compared with the conventional variety; however, Bollgard cotton produced significantly fewer damaged bolls and bollworm adults than the conventional variety. Production of large larvae, damaged bolls, and adults was decreased dramatically by Bollgard II cotton as compared with Bollgard and conventional varieties. When comparing insecticide-treated and nontreated cotton genotypes, both Bt cotton sustained less boll damage than the conventional variety averaged across insecticide regimes; furthermore, Bollgard II cotton had fewer damaged bolls than the Bollgard variety. When averaged across cotton genotypes, pyrethroid oversprays reduced the numbers of damaged bolls compared with the nontreated cotton. Insecticide-treated Bollgard cotton, along with insecticide-treated and nontreated Bollgard II cotton reduced production of bollworm larvae, pupae, and adults. However, the addition of pyrethroid oversprays to Bollgard II cotton seemed to be the best resistance management strategy available for bollworm because no bollworms were capable of completing development under these conditions.     

A male and hermaphrodite specific RAPD marker for papaya ( Carica papayaL.)

The random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique was used to determine the sex of a dioecious species, Carica papaya L., with three sex types, male, female and hermaphrodite. A 450 bp marker fragment, named PSDM(Papaya Sex Determination Marker), exists in all male and hermaphrodite plants but not in the female plants so far analyzed. The DNA sequence of PSDM exhibited no significant similarity to previously reported sequences. A sequence-characterized amplified region (SCAR) marker, SCARps, was developed from PSDM to determine the sex of papaya. Southern hybridization, using PSDM as a probe, showed that PSDM exists in the male and hermaphrodite genomes, but not in the female genome. This result strongly suggests that PSDM is located on the chromosome region that is specific to the male and the hermaphrodite. SCARps is a suitable marker for the precise and rapid diagnosis of sex in papaya. Received: 1 February 2001 / Accepted: 22 May 2001