山羊β-酪蛋白基因启动子指导人血清白蛋白基因在小鼠组织中的特异性表达

对本所构建的pcDNA3.1-β6.7hALBm表达载体行尾静脉注射直接转染哺乳期母鼠的活体组织.通过RT-PCR检测hALBm基因在小鼠几种组织中的表达来研究该构建体的组织特异性.结果:构建体在受试鼠组织中的表达显示了较好的乳腺组织特异性.说明构建具有较长5′端上游乳蛋白调控区的乳腺特异性表达载体对组织特异性表达是必需的。 Abstract:The mammary gland expression recombinant construct,pcDNA3.1-β6.7hALBm,was directly delivered into the lactating mice via tail vein injection mediated by DOTAP liposome.The expression of hALB mRNA in various mouse tissues was determined by RT-PCR method.The results showed that pcDNA3.1-β6.7hALBm presented a specificity in the mouse mammary gland expression,indicating that it was essential to construct a mammary gland expression vector with even longer 5′ upstream regulatory region of the milk protein genes for the tissue-specific expression of foreign in the transgenic animals.     

建立外源基因乳腺组织特异性表达快速检测系统的探索

乳腺生物反应器研制是近年来生物工程领域的研究热点,有效的乳腺组织特异性表达载体的构建则是该工作的关键。为了验证外源基因乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性,我们实验室探索利用重组逆病毒（retrovirus）、重组腺病毒（adenovirus）和SA脂质体（SAliposome）为介导,将外源基因及其表达构件导入活体奶山羊的乳腺组织,建外源基因乳腺组织表达的快速检测系统;取得了较为理想的效果。     

牛β-酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中的表达调控

构建牛β 酪蛋白基因控制的人凝血Ⅸ因子 (hFⅨ )乳腺组织特异性表达载体pCⅨm,pCiⅨ ,pCⅨ和报告基因 (LacZ)乳腺表达载体 pCiLacZ ,pCLacZ ,利用Stearylamine(SA)阳离子脂质体包埋 5种载体 ,通过尾静脉注射的方法直接转染哺乳期母鼠的活体组织 .在DNA ,mRNA以及蛋白质水平对实验小鼠的检测结果表明 :转染处理后hFⅨ基因和LacZ基因在小鼠乳腺获得表达 ,hFⅨ蛋白在乳汁中的最高分泌表达量为 80 .2 8ng/mL ,其中 85 %以上已经羧基化并具有生物学活性 ;对 5种载体表达调控的研究证实牛β_酪蛋白基因 5′端 2 .0kb的片段能够驱动人凝血Ⅸ因子基因在小鼠乳腺组织中分泌表达 ,β_酪蛋白基因内含子 1能够提高Ⅸ因子基因在乳腺组织中的表达水平 ,并能影响该基因表达的组织特异性 ;和hFⅨcDNA相比 ,hFⅨ基因自身的内含子 1能够提高该基因在活体乳腺组织中的表达水平 3倍以上     

猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体的构建

为构建猪PBD-1基因乳腺特异性表达载体,采用PCR方法从质粒pcDNA3.1-BLG-HNP-1中扩增出山羊乳球蛋白(BLG)基因,插入到真核表达载体pIRES2-EGFP-PBD-1构建成乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,鉴定.结果成功构建了乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1.乳腺特异性表达载体pIRES2-EGFP-BLG-PBD-1的成功构建,为进一步研究PBD-1蛋白的抗菌活性、抗菌机理及将进一步该载体应用于动物乳腺生物反应器的研究奠定基础.     

β乳球蛋白基因（βlg）的表达调控及其应用

β乳球蛋白（BLG）是反刍动物乳汁中的主要乳清蛋白,BLG表达受到βlg核心启动子,LCR,MAR等顺式作用元件和激素,转录因子等反式作用因子的调控,利用βlg启动子已在乳腺成功表达外源基因,但乳腺组织特异性表达外源基因时尚存在异位表达,差异表达,表达水平低和表达受位置效应影响等问题,构建表达载体时充分考虑βlg启动子和远端调控元件,有可能使上源基因获得,高效,特异的表达。     

乳腺生物反应器特异高效表达载体的构建

乳腺生物反应器具有广阔的开发前景,而提高目的基因的表达量是该领域一个重要的研究课题。因此,选用强的非特异性启动子pCAG,而不是乳腺特异性启动子来实现高效表达;通过Cre/loxP系统和山羊β-乳球蛋白启动区（pBLG）表达Cre重组酶来实现载体的自删除以达到乳腺特异表达的目的。方法：构建含PolyA终止信号的Cre乳腺特异表达元件PolyA-pBLG-cre,插至强启动子pCAG驱动的报告基因lacZ表达载体中,构建成乳腺特异表达载体pCBCZ（pCAG-loxP-PolyA-pBLG-cre-loxP-lacZ）。转染细胞实验结果：PCR鉴定确认pCBCZ载体在小鼠乳腺上皮细胞（HC11）中发生Cre-loxP同源重组。X-Gal染色表明载体能驱动lacZ在HC11细胞中高效表达β-半乳糖苷酶,而在NIH 3T3细胞中仅少量表达。结论：构建的pCBCZ载体能高效驱动外源基因在乳腺细胞中表达,且具有较好的乳腺特异性,为研发乳腺生物反应器表达载体提供新的方法。     

植物基因工程中人工启动子的研究进展

启动子是调控基因转录的一段DNA,也是构建基因工程表达载体的重要元件。天然启动子在表达强度和特异性等方面存在一定的局限性。采用人工构建的方法,有望得到诱导因子广、本底活性低、表达强度高、启动表达快等特点的启动子。本文综述了人工启动子在诱导表达、组织特异性表达、高效表达等方面的研究进展。     

乳腺生物反应器表达载体的检测方法

乳腺生物反应器研究和开发的周期长 ,成本大 ,风险高 ,在生产转基因动物之前有必要对乳腺特异性表达载体构建的合理性和有效性进行检测。综述了国内外载体检测研究的进展 ,以及这些检测方法在转基因小鼠、动物乳腺内表达法和细胞培养中的应用     

表达人尿激酶原突变体的重组山羊乳腺特异性表达慢病毒载体的构建

目的：构建山羊乳腺特异性表达尿激酶原突变体的重组慢病毒载体,证明其表达的有效性。方法：将劳氏肉瘤病毒增强子／启动子、复制缺陷型人免疫缺陷病毒（HIV-1）的5′端长重复序列（LTR）、HIV-1ψ包装信号、HIVRev反应元件、山羊β-酪蛋白调控序列、尿激酶原M13cDNA、AU3／3′LTR、牛生长激素（BGH）基因poly（A）依次连接,构建乳腺特异性表达的慢病毒载体,通过体外转染人乳腺癌细胞系MCF-7、中国仓鼠卵巢细胞及泌乳山羊乳腺注射证明其表达有效性。结果：酶切鉴定证实山羊乳腺特异性表达载体构建正确;将该载体转染细胞,采用溶圈法和Western印迹检测证实了其表达的有效性;慢病毒载体注射到泌乳山羊的乳腺,在乳汁中也检测到了尿激酶原的表达。结论：为在转基因动物乳腺中表达尿激酶原突变体奠定了基础。     

不同启动子对于牛催乳素表达的调控作用

在细胞水平上比较不同启动子对于牛催乳素(bPRL)表达的调控作用.分别构建了以CMV启动子、牛催乳素基因启动子和山羊β-酪蛋白基因启动子作为调控元件的bPRL真核细胞表达载体,分别命名为pCMV、pPRLP和pP1A3.将3种载体分别转染小鼠垂体瘤细胞和小鼠乳腺上皮细胞,使用RT-PCR和定量RT-PCR分析3种启动子启动bPRL在2种细胞系中的表达效果.pCMV在2种细胞中有效表达bPRL;pPRLP在2种细胞中的表达效果与pCMV接近:pP1A3不在垂体细胞中表达,在乳腺细胞中表达.pPlA3具有乳腺表达特异性;pPRLP能够在垂体和乳腺中高表达,在其他组织的表达特异性有待进一步研究.     

豌豆肌动蛋白异型体基因的特异性表达

将分属三类豌豆（Pisum sativum）卷须肌动蛋白异型体（PEAc）的基因3'端进行了亚克隆,并利用限制性内切酶从中切取了完整的3'非翻译区片段,将之做为特异性探针进行DIG标记,并对不同发育时间豌豆根、茎、叶及花粉中提取的总RNA进行点杂交分析。发现其中I类（PEAcI）和II类（PEAcII）在根、茎、叶中都有表达,但存在发育时间上的表达特异性,尤其在叶中的差异较明显。而III类（PEAcIII）与前二者的差别更大,仅发现其在2 d及28 d的根、7 d的茎及18 d的叶中有表达。在花粉中,只有PEAcII有少量的表达,说明三类异型体基因的表达还存在组织特异性。     

AtSTP3启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异表达研究

利用PCR技术从哥伦比亚型拟南芥基因组DNA中分离了AtSTP3绿色组织特异表达的启动子,序列分析表明,扩增片段(1774bp)与已报道序列的相应区域同源性达99.9%。将其与GUS报告基因融合在一起,构建了植物表达载体,并由农杆菌介导法导入水稻品种‘中花11’中。对转基因水稻植株中的GUS活性进行定性与定量测定结果表明,AtSTP3启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片中特异性表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,AtSTP3启动子表现出明显的组织特异性。     

豌豆肌动蛋白异型体基因的特异性表达

将分属三类豌豆（Pisum sativum）卷须肌动蛋白异型体（PEAc）的基因3'端进行了亚克隆,并利用限制性内切酶从中切聚了完整的3'非翻译区片段,将之做为特异性探针进行DIG标记,并对不同发育时间豌豆根、茎、叶及花粉中提取的总RNA进行点杂交分析。发现其中Ⅰ类（PEAcⅠ）和Ⅱ类（PEAcⅡ）在根、茎、叶中都有表达,但存在发育时间上的表达物质特异性,尤其中叶叶的差异较明显,Ⅲ类（PEAcⅢ）与前二者的差别更大,仅发现其有2d及28d的根、7d的茎及18d的叶中有表达。在花粉中,只有PEAcⅡ有少量的表达,说明在类异型体基因的表达还存在组织特异性。     

人凝血IX因子基因乳腺组织特异性表达载体的构建及其在奶山羊乳腺中的分泌性表达

血友病B(Hernophilia B)是由于人凝血IX因子(hFIX)缺乏所致的一种严重出血性疾病。常规治疗方法是通过输血或输入人浓缩凝血IX园子来实现的,因此患者很容易被肝炎病毒甚至爱滋病毒感染。近年来,人们期望通过转基因动物乳腺表达并从乳汁中分离生产hFIX蛋白,以解除血友病患者的痛苦。以转基因动物的乳腺组织即乳腺生物反应器生产外源蛋白具有原核生物,酵母以及离俸真核细胞生产系统所不具备的优点：生产的外源蛋白经过体内加工和修饰,特别是真核蛋白的转译后加工(如糖基化和羧基化)．其生化特性、生物学活性与天然蛋白完全相同^[1];另外从乳汁中生产外源蛋白不需要复杂的工厂设备。因此开展人凝血IX因子乳腺生物反应器的研究具有重要的经济意义和临床应用价值。转基因动物乳腺生物反应器的关键在于外源基因乳腺组织特异性表达载体的构建。我们利用小鼠MAR元件(Matrix attachment regions)．牛的β-casein基因调控顺序,hFIX mini-gene和hFIX cDNA分别建成两种乳腺组织特异性表达载体pMCIXm和pMCIX,经SA脂质体包埋载体DNA后直接转染奶山 羊乳腺小叶,hFIX蛋白在奶山革乳汁中获得瞬间分泌性表达,最高表达量为13.7ng/ml乳汁。其中含hFIX mini-gene的表达载体在奶山羊乳汁中的表达量高于含hFIX cDNA的表达载体．表明hFIX的in-tronl能够提高该基因在活体奶山羊乳腺中的表达。A7单抗和柠檬酸钡吸附检测表明乳汁中的hFIX 蛋白羧基化和活性比率都在90％以上。以上结果肯定了载体构建的正确性．不但为研制hFIX蛋白乳腺生物反应器提供了有效的表达载体,同时也表明利用阳离子SA脂质体包埋质粒DNA直接转染活体物乳腺可以作为验证乳腺表达载体构建正确性的快速检测手段。     

人红细胞生成素乳腺特异性表达载体构建及其可行性检验方法的建立

将大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列与人红细胞生成素基因组ＤＮＡ融合,构建了ｐＷＡＰ－ＥＰＯ－ＷＡＰ３乳腺特异性表达载体,该载体经脂质体包裹后,通过显微外科技术,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。经ＥＬＩＳＡ检测,大鼠乳汁中有ＥＰＯ表达,外周血网织红细胞计数法测定表达的ＥＰＯ具有体内生物活性,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异性表达载体可行性方法     

心肌特异性高表达热休克蛋白27转基因鼠建立

目的 建立人热休克蛋白27（heat shock protein 27, Hsp27）基因在小鼠心肌特异性表达的转基因鼠模型。 方法 将人心肌Hsp27cDNA插入含有心肌特异性表达启动子αMHC的pBSⅡ-SK+载体中,限制性内切酶EcoRI酶切、纯化后,获得含有αMHC启动子－Hsp27cDNA－HGH polyA的线性DNA片段,以显微注射法将目的基因导入受精卵, PCR筛选基因型,Western Blot鉴定转移基因的表达和表达的组织特异性。结果和结论 共获得两个转基因系小鼠,均呈心肌组织特异性高表达。     

抗山羊ΔfosB基因表达产物抗体的制备及应用

ΔfosB是fosB基因的自然截短型,稳定存在于许多组织中,在脂肪细胞和成骨细胞的形成和分化中起到重要作用。ΔFosB蛋白可能与钙在骨和乳腺中的代谢有关,并且调控钙从骨向乳腺转移的信号通路。将奶山羊的ΔfosB基因亚克隆到pET32a载体得到pET32a-ΔfosB原核表达载体,IPTG诱导其在大肠杆菌中表达,纯化融合蛋白免疫兔子制备多克隆抗体。ELISA检测显示抗体效价达1:51200,Western blotting结果显示制备的抗体能特异性检测原核表达的ΔFosB蛋白以及在HEK-293细胞中表达的ΔFosB蛋白。进一步的组织差异表达检测表明ΔFosB在山羊的乳腺、骨髓、脑髓、肌肉、心脏、肝和肺组织中均有表达。     

表达人溶菌酶基因牛乳腺特异表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺酪蛋白基因的1.8kb和1.1kb的5'和3'调控 序列,克隆入TA载体.经测序鉴定后,利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体 pcDNA3(切除CMV启动子),并插入人溶菌酶基因(hLYZ)的cDNA, 构建成牛乳腺特异表达 载体.获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定、PCR验证等表明,成功克隆了酪蛋白基因5 '和3'的调控区,并成功构建了表达人溶菌酶基因的牛乳腺特异表达载体.     

gfP基因甘蓝质体表达载体构建及原核表达分析

以甘蓝自交系‘03097’为试材,PCR扩增并克隆了甘蓝质体的trnI-trnA基因区段,利用该基因区段作为定点整合外源基因的同源重组片段,构建了甘蓝质体定点转化载体,并进行了原核表达分析。结果表明,所扩增的基因区段大小为2.7 kb。进行序列分析后,经酶切、连接和转化,构建成含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的质体表达载体,酶切鉴定表明,所构建载体符合预期设计;gfp基因能够在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下高水平表达,表达量约占总可溶性蛋白的41.0%,包涵体占菌体蛋白的38.0%。该载体的构建为后期甘蓝质体转化体系的建立和其它功能基因导入甘蓝质体进行性状改良奠定了基础。     

血管生成抑制因子arresten基因的克隆表达

构建血管生成抑制因子arresten基因的原核表达重组体 ,并进行初步表达。从人胎盘组织中提取总RNA ,经反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR)扩增出arresten基因 ;采用T A克隆法 ,将arresten基因克隆入pGEM T载体中 ,经DNA测序确认后 ,构建原核表达重组体pRSET Arr,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,用IPTG诱导表达。所获得的arresten基因经测序正确 ,并表达重组蛋白 ,经SDS PAGE分析 ,相对分子量为 2 6ku。构建的原核表达重组体pRSET Arr能高效表达重组arresten蛋白。