克隆猪技术及其在转基因猪研究中的应用

哺乳动物核移植技术是一种可以获得基因组遗传信息完全相同的后代的生物技术。猪体细胞核移植技术包括以下几个环节：卵母细胞的体外成熟、供体细胞的分离和处理、体细胞的核转移、重构胚胎的人工激活、胚胎体外培养和胚胎移植。由于该技术在最近几年的迅速发展,很多实验室已通过该技术成功获得了克隆猪后代。核移植克隆猪技术的出现为生产转基因猪提供了一种有效的方法,并且是目前生产基因打靶猪的惟一方法。至今利用克隆猪技术已经成功获得了一系列的转基因猪和基因敲除猪。以核移植技术产生基因修饰猪目前正处于从基础研究走向应用的过渡阶段。尽管猪体细胞核移植克隆的效率（出生克隆猪数占所用卵数的比例）还不高,但是由于通过该技术能够对猪基因组进行特定的修饰,确保生产的克隆动物100％为转基因动物,从而大大提高了转基因猪的制作效率,可以预料猪核移植技术将会对医药业和农业产生重大的影响。     

人红细胞生成素乳腺特异性表达载体构建及其可行性检验方法的建立

将大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列与人红细胞生成素基因组ＤＮＡ融合,构建了ｐＷＡＰ－ＥＰＯ－ＷＡＰ３乳腺特异性表达载体,该载体经脂质体包裹后,通过显微外科技术,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠乳腺中进行表达。经ＥＬＩＳＡ检测,大鼠乳汁中有ＥＰＯ表达,外周血网织红细胞计数法测定表达的ＥＰＯ具有体内生物活性,说明乳腺导管注入法是一种较理想的评价乳腺特异性表达载体可行性方法     

tPA cDNA在兔乳腺中的表达(英文)

组织型纤维原激活剂（tPA）的作用是激活血纤维蛋白酶原,从而溶解血栓。生物体内tPA的含量很低,远远不能满足临床需要。为了利用转基因动物生产tPA,需要对所用tPA乳腺表达载体pSVL－WAP－tPA2（Fig．1）进行予证。将三种待研究载体分别用脂质体包埋,注入中后期怀孕母兔乳腺。对乳汁、乳腺组织的mRNA和DNA分别进行检测。实验兔分娩后,每4天取乳汁冻存,ELISA检测其中tPA含量（Fig．2）,泌乳期第4天最高可达600ng／ml。又,于乳腺注射第3天,手术切取部分乳腺组织,制备总RNA,以β－Casein启动子下游序列（TACTAG…）为引物Ⅰ,tPA上游序列（TTCCCA…）为引物Ⅱ,做RT－PCR检测,表明：此时已有tPAmRNA转录（Fig．3）。再,于停乳后30天左右,切取部分乳腺制备DNA,以tPAcDNA为探针,做Southern杂交检测,表明：无tPA整合,仅是以附合体形式存在（Fig．4）。上述质粒直接注射技术是予证转基因用载体表达水平的快捷、简便方法。     

基于体细胞克隆的猪基因打靶技术研究进展

基因打靶猪在农业和生物医药领域均有广泛用途。由于猪的能参与生殖系嵌合体的多能性干细胞尚未建立成功,基因打靶猪的培育主要是通过体细胞克隆技术来实现。最初,人们在体细胞上通过传统的同源重组技术成功地建立了基因敲除克隆猪,但体细胞在体外的增殖能力有限,传统同源重组在体细胞的打靶效率极低。虽经十多年的发展,但在世界范围内获得的基因打靶猪屈指可数。最近,三种工程核酸酶介导的基因编辑技术(ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9)的出现,使体细胞的基因打靶效率大大提高。多个实验室将其用于猪,实现了高效基因打靶,并在很短的一段时间里,获得了一系列基因打靶猪。就传统同源重组技术以及近几年发展起来的新兴基因编辑技术在基因修饰猪的应用研究进展进行了综述。     

利用CRISPR/Cas9系统构建Tiki1基因修饰猪模型

Tiki1基因是哈佛大学儿童医学院贺熹教授实验室发现的一个对蛙头部的诱导起到决定性作用的新基因,但Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因此无法利用小鼠等小动物来研究其在哺乳动物中的作用.本文利用CRISPR/Cas9系统结合体细胞克隆技术构建Tiki1基因修饰猪模型,研究Tiki1基因在猪发育中的作用.我们利用贺熹教授团队提供的人Tiki1基因序列,在猪的基因组数据库中比对出与其同源性最高的一段序列设计2个靶位点(g1和g2).以设计的靶位点构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了52个单细胞克隆株.最终选择靶位点g1为纯合双敲的5个单细胞克隆株和靶位点g2为纯合双敲的3个单细胞克隆株作为构建Tiki1基因敲除猪的核供体.我们共计构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,其中有1头经B超检测成功怀孕并妊娠到期产下13头发育正常的克隆猪,经测序鉴定其中12头为Tiki1基因双敲除猪模型,Tiki1基因敲除克隆猪健康存活至今.结果表明Tiki1基因对于猪早期发育的作用机理不同于蛙,其在猪早期发育的过程中的具体作用机理有待后续进一步的深入研究.     

利用人工核酸酶构建基因编辑猪的研究进展

猪不仅具有重要的农业生产价值,由于猪繁殖周期比灵长类动物短,产仔量多,以及猪器官大小、生理代谢过程和解剖结构,尤其是心血管系统及神经系统较啮齿类动物而言与人类更为接近,猪在生物医药领域也具有重要的用途。对猪基因组加以编辑,在农业上可以加速高生产性能猪新品种的培育;在生命科学领域可用于基因功能、胚胎发育及代谢过程等基础研究;在医学上,可提供与人体更为匹配的异种移植器官,可作为更能准确模拟人类疾病的大动物模型,用于新的药物和治疗手段的开发。人工核酸酶的出现,使基因编辑效率得到大大提高,克服了原有的基因编辑猪制备困难、成功率极低的问题。人工核酸酶技术不仅在猪上实现了高效而又精确的基因编辑,并且使各种基因突变模式,如基因敲除、基因敲入、基因组无痕点突变、多基因编辑、体内直接基因编辑以及条件性基因编辑等都成为可能。现将对利用不同人工核酸酶技术结合不同的基因编辑策略建立基因编辑猪的研究新进展进行综述。     

人组织型纤溶酶原激活剂c-DNA乳腺定位表达载体的构建及其在兔乳腺中的表达

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是一种用于治疗血栓性心血管疾病的特效药物,它能激活血纤维蛋白酶原,后者使血块溶解,所以这种药物的开发为社会普遍重视。t-PA在人体血液中的含量极低,很难从天然材料中提取。如果应用转基因技术,将人t-PA基因转入动物体内,使其在乳腺中高效表达,从乳汁中提取大量的t-PA,将具有可观的经济效益和社会效益。 转基因动物建立的前提条件是构建乳腺定位高效表达载体。为此,我们先将本所保存的t-     

肌注组织型纤溶酶原激活剂基因在小鼠体内表达

组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)是人体内重要的丝氨酸蛋白酶,它能特异地激活血栓中的纤溶酶原,使之成为具有溶解纤维蛋白能力的纤溶酶,临床上将提纯的t-PA作为心血管栓塞性疾病急救和康复治疗的首选药物。由于t-PA在天然材料中含量甚微,难以大量制备,基因工程产品产量有限,临床应用货源紧缺且价格昂贵。为探索心血管疾病的基因治疗和预     

家兔囊胚在饲养层上的生长行为

研究了家兔囊胚在饲养层上的生长行为。结果表明,滋养层细胞铺展后,形成一层透明的膜状结构。覆盖在内细胞团之上。内细胞团在４８小时后,可见到一定程度的增殖,第３天增殖速度加快。生长的内细胞团可呈团状、条状、网状和混合型四种形态。混合型内细胞团分化出现较早,呈团状、条状和网状生长的内细胞团分化较晚。团状内细胞团一般在原位生长,而呈条状和网状生长的内细胞团增殖很快并迅速扩展到各处。滋养层细胞覆盖于未分化的