人NFBD1启动子的鉴定与初步分析

NFBD1,也称MDC1,是一个参与细胞内DNA损伤后细胞应答反应的重要分子.为了进一步深入研究其转录调控机制,本研究克隆鉴定了NFBD1的启动子.首先应用5′ RACE技术鉴定了NFBD1的转录起始位点,首次发现NFBD1至少存在3种丰度和转录起始位点不同的转录变异体.然后,通过PCR定向克隆和酶切亚克隆策略,构建了覆盖NFBD1基因5′侧翼区起始密码子ATG上游5 kb区域的一系列NFBD1启动子荧光素酶报告基因重组体.启动子活性分析表明,NFBD1启动子区域定位于主要转录起始位点区域附近1.5 kb的区域内.采用转录因子结合位点预测分析软件分析表明,NFBD1启动子缺乏TATA盒,但含有典型的CCAAT盒和GC盒以及其它潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和NF-Y等转录因子可能参与NFBD1的转录调控     

人PRR11启动子的结构与功能初步分析

PRR11（proline-rich protein 11,PRR11）是我们最近发现的一个新的肿 瘤相关基因.初步研究表明, PRR11参与细胞增殖、细胞周期和细胞癌变等多种生 物学过程．为了进一步研究PRR11基因的转录调控机制并全面解析其功能,本研究 对PRR11基因的启动子进行了克隆鉴定和初步分析．首先,应用5' RACE（rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增）技术鉴定了PRR 11基因的转 录起始位点,发现了其具有多个转录起始位点．通过PCR定向克隆和DNA blunting 技术,构建了6个相互重叠并覆盖PRR 11基因转录起始位点附近约2.0 kb区域的 PRR 11基因启动子荧光素酶报告基因重组体．启动子活性分析表明,PRR 11基因 启动子主要定位于转录起始位点附近-563 bp～+341 bp的区域内．采用转录因子 结合位点预测分析软件分析表明,PRR 11基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有 典型的GC盒、CCAAT盒以及潜在的经典转录因子E2F1和MYB的结合位点,提示Sp1、 NF-Y、E2F1和MYB等经典转录因子可能参与PRR 11基因的转录调控．     

人ACER2基因启动子的鉴定与初步分析

碱性神经酰胺酶2(alkaline ceramidase 2,ACER2)是一个参与脂质类信号分子神经酰胺代谢的酶分子,在细胞增殖、衰老和凋亡等过程中起重要作用。为了进一步研究ACER2基因的转录调控机制,该研究克隆鉴定了ACER2基因的启动子。首先,应用5'RACE(rapid amplification of cDNA ends,cDNA末端快速扩增)技术鉴定了ACER2基因的转录起始位点。然后,通过PCR定向克隆和定点突变策略,构建了三个长度不同的覆盖ACER2基因5'端侧翼区起始密码子ATG上游约1.3Kb区域的一系列ACER2基因启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析表明ACER2基因启动子定位于转录起始位点附近约670 bp的区域内。转录因子结合位点分析结果表明,ZCER2基因启动子含有Sp1、GATA-1和AP-1等潜在的转录因子结合位点,提示Sp1和GATA-1等转录因子可能参与ACER2基因的转录调控。     

人FAM33A基因启动子的克隆与鉴定

目的鉴定人FAM33A基因的启动子,为进一步研究其转录调控机制奠定基础。方法采用5’RACE技术（5’端cDNA快速扩增）鉴定FAM33A的转录起始位点。采用PCR定向克隆、酶切亚克隆等策略,构建FAM33A启动子荧光素酶报告基因。采用Lipofeetamine^TM2000转染H1299细胞,并通过Dual-Lu-ciferase@ Reporter Assay System进行荧光素酶报告基因活性检测。结果确定了FAM33A的转录起始位点,构建了覆盖FAM33A 5’端ATG附近约2kb区域的一系列FAM33A启动子荧光素酶报告基因。启动子活性分析表明,这些重组体均具有较高的启动子活性,同时含有典型的GC盒以及Sp1、E2F和GATA-1等潜在的转录因子结合位点。结论FAM33A启动子区域主要定位于转录起始位点附近约590bp的区域内。     

棉铃虫中肠P450CYP6B6基因5'上游序列的克隆及序列分析

已证实2-十三烷酮等植物次生物质的胁迫会诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP6B6基因的过量表达[1].为探明棉铃虫P450 CYP6B6基因的表达调控机制,根据棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因cDNA序列(GenBank登录号:AY950636),运用基因组步移的方法获得其5'上游区的序列,用启动子区的分析软件进行比对分析,结果得到棉铃虫P450CYP6B6基因5'上游区域1 333 bp的基因片段.分别运用NNPPv.2.2和TRANSFAC v.6.0预测转录起始位点及分析了转录因子结合位点,结果显示,该序列不仅包括TATA盒等这一类核心结构序列,还含有多个转录因子的结合位点,如GATA-1、Dfd、C/EBP、HSF、cytR和AhR(芳香烃受体化合物应答元件)等.该结果为深入研究棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定分子基础.     

人FXR基因5′调控区功能分析

为研究人法尼酯衍生物X受体（FXR）基因5′调控区的功能,在对人FXR基因进行生物信息学分析的基础上,用5′RACE法确定该基因的转录起始位点碱基是A.采用PCR技术,扩增人基因组DNA中FXR基因5′上游序列,构建了5种含不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达体系.将它们瞬时转染HepG2细胞,检测其荧光素酶活性.结果表明,－1　651～+200、－1　496～+200区域的启动子活性无明显区别,－847～+200区域的启动子活性最高,－544～+200区域启动子活性较前显著降低.研究提示,FXR基因转录所必需的基因启动子序列在－847～－544范围内.     

人LOXL2启动子的鉴定与初步分析

LOXL2（lysyl oxidase like 2）是赖氨酰氧化酶（LOX）家族的一个重要成员,不仅可促进细胞外基质中胶原蛋白和弹性蛋白的交联,而且在转录调控、细胞信号转导以及细胞粘附等生物学过程中也有重要作用。多篇研究表明,LOXL2在多种肿瘤中高表达,且与多种肿瘤细胞的增殖迁移等生物学行为密切相关。LOXL2的表达调控机制目前仍不清楚。为了进一步研究LOXL2的转录调控机制,本研究克隆鉴定了LOXL2的启动子。首先通过数据库对LOXL2基因结构及潜在启动子区域进行了分析,进而以人的基因组DNA为模板,通过PCR定向克隆策略,构建了5个长度不同并覆盖LOXL2基因转录起始位点附近约1.7 kb的LOXL2基因启动子荧光素酶报告基因重组体。启动子活性分析结果表明,与对照组相比,5个重组体均具有启动子活性(P<0.05),提示LOXL2基因核心启动子定位于转录起始位点附近约185 bp的区域内。转录因子结合位点分析结果表明,LOXL2基因启动子缺乏典型的TATA盒,但含有GC盒以及Sp1、NFkB等潜在的转录因子结合位点。外源转染Sp1表达质粒能显著增强LOXL2基因启动子的活性（P<0.05）,提示Sp1能直接激活LOXL2的转录。     

棉花腺苷酸核糖基化作用因子1(arf1)的结构特征、替换剪接和遗传表达分析

用已建立的新型染色体步移技术同尾酶反向PCR和快速分离目的基因cDNA 5′未知序列方法从陆地棉品种Y18中分离到腺苷酸核糖基化作用因子1(arf1)的全长cDNA、DNA和启动子序列。结果表明,该基因全长4360bp,具有6个内含子和7个外显子,在第一个内含子处存在替换剪接现象,使该基因在棉花中分别形成1026、1103和1544bp的3种mRNA。该基因编码181个氨基酸,转录起始位点上游具有转录起始子、TATA盒、CAAT盒、GC盒、多个正向重复序列和反向重复序列,在转录起始位点下游具有富含AT序列和回文结构等启动子特征序列。Southern杂交结果表明：该基因在棉花基因组中有两个拷贝。Northern杂交结果表明：该基因在棉花的蕾、花、纤维和铃壳等生殖器官中呈优势表达。     

猪CuZnSOD基因启动子的克隆鉴定及分析

猪铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)是一种重要的抗氧化酶,其功能已被广泛研究,但CuZnSOD基因的转录调控尚不明确。为了研究猪CuZnSOD基因的核心启动子区域,并对其转录调控机制进行探讨,运用PCR方法从猪基因组克隆CuZnSOD基因5′上游调控区853 bp的片段,然后通过巢式PCR方法获得5′末端逐渐缺失的启动子系列片段,并将这些片段定向插入到荧光素酶报告基因表达载体(pGL3-Basic)中。瞬时转染小鼠胚胎细胞(NIH/3T3),利用双荧光素酶报告基因检测不同长度启动子活性。检测结果显示,在CuZnSOD基因5′上游调控区-87 bp和-266 bp处分别存在2个潜在转录起始位点,-383 bp~+67 bp启动区活性最强,进一步缺失分析发现-75 bp~-32 bp区域内含有猪CuZnSOD基因转录所必需的基础启动子序列,其中存在多个潜在的转录因子结合位点,研究结果提示这些转录因子结合位点可能是参与CuZnSOD基因转录的重要调控序列。     

人A4GNT基因5'调控区的结构和功能分析

为探索人α1,4-N-乙酰葡糖胺转移酶(α1,4-N-acetylglucosaminyltransferase,A4GNT)基因表达的调控机制,应用5'cDNA末端快速扩增法和引物延伸法确定了A4GNT基因的转录起始位点.在生物信息学分析的基础上,构建了系列5'缺失荧光素酶报告基因载体和定点突变载体.瞬时转染胃癌细胞MKN45和AGS.荧光素酶活性分析表明,A4GNT基因转录的核心启动子在-141bp～+116bp区域,该区域缺乏典型的TATA盒,但含有CCAAT盒、Sp1和ETS-1等转录因子潜在结合位点.突变分析显示,-136bp～-131bp的Sp1结合位点及-93bp～-89bp正向CCAAT序列对A4GNT启动子转录激活至关重要.电泳迁移率变动分析表明,这两个顺式作用元件能够与转录因子Sp1和NF-Y结合.另外,在-1464bp～-771bp区域可能含有与基因的特异性表达相关的调控元件.     

EGFR基因启动子区甲基化状态分析

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是HER/ERB-B跨膜受体激酶家族成员之一.EGFR的过表达促进细胞的增殖、存活和迁移,与许多实体瘤病人的低存活率相关.EGFR的表达受其启动子DNA甲基化调控.EGFR的转录沉默与CpG岛高甲基化相关.EGFR基因5′调控区包括1个富含GC的启动子,缺保守序列TATA盒和CAAT盒,有多个位点可以起始转录.本实验运用Bisulfite Sequencing PCR(BSP)方法检测了2种肿瘤细胞HeLa(EGFR+)和K562(EGFR)EGFR基因-1300～+600的甲基化状态.所检测目的片段共包含178个CpG位点.发现EGFR阳性与EGFR阴性两种细胞系的甲基化状态不同:宫颈癌细胞系HeLa转录起始点附近包括第一外显子区(-244～+91)处于非甲基化状态,白血病细胞系K562转录起始点附近包括第一外显子区呈嵌合性的高甲基化状态.因此,第一外显子比启动子区的甲基化状态更能反映基因的活化状况.