亚油酸刺激胰岛β细胞胞浆游离钙水平升高的机制

为明确亚油酸影响胰岛β细胞的胞浆游离钙水平([Ca2+]i)的作用和机制,本研究运用胶原酶灌注消化法原代培养大鼠胰岛细胞,使用钙离子荧光指示剂Fluo-3负载细胞后在共聚焦显微镜下观察Fluo-3荧光强度以反映[Ca2+]i变化,灌流给药观察亚油酸等药物的作用,记录结束后采用免疫细胞化学染色方法鉴定β细胞。结果显示,亚油酸(20μmol/L)刺激β细胞[Ca2+]i升高,表现为最初的峰型升高和随后的较为持久的平台期升高。平台期升高可被去除细胞外液中Ca2+所阻断,也可被瞬时受体电位(transient receptor potential,TRP)通道的阻断剂La3+所抑制,峰型升高和平台期升高均被耗竭细胞内钙库的Ca2+或者抑制磷脂酶C活性所阻断。结果表明,亚油酸通过刺激β细胞内钙库的Ca2+释放和激活TRP通道,导致[Ca2+]i升高。     

脾气虚大鼠肝组织三磷酸腺苷酶活性和CaMKⅡ通路CaM、CaMKⅡ蛋白表达的变化

目的观察脾气虚大鼠肝组织三磷酸腺苷酶活性和CaMKⅡ通路关键分子[Ca2+]i以及CaM、CaMKⅡ、p-Ca MKⅡ蛋白表达水平的变化。方法受试动物随机分为4组,即空白对照组,脾气虚模型7 d、14 d、21d组,每组12只。除空白对照组外,其余受试动物采用复合法(苦寒破气法、游泳力竭法及饥饱失常法)成功建立脾气虚证大鼠模型,在观测各组大鼠一般生存状态和肝组织ATP酶活性的基础上,采用激光共聚焦技术检测肝组织细胞内[Ca2+]i浓度,蛋白免疫印迹技术检测肝组织CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ的表达变化。结果与空白组比较,脾气虚大鼠随着造模时间的延长,一般生存状况渐差,肝组织Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均降低(P0.05,P0.01);肝组织[Ca2+]i浓度和CaM、CaMKⅡ、p-Ca MK Ⅱ蛋白表达量显著降低(P0.01);且脾气虚模型7 d、14 d、21 d组之间比较,以脾气虚21 d组变化更为显著。结论脾气虚大鼠肝组织Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性和[Ca2+]i浓度降低,并且CaMKⅡ信号通路关键分子CaM、CaMKⅡ和p-CaMKⅡ蛋白表现为低表达。     

大黄素影响巨噬细胞升高[Ca~(2+)]_i和释放TNF-a的作用特征

为了研究大黄素(emodin)对正常的和细菌脂多糖(LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞(PM准)释放肿瘤坏死因子琢(TNF-琢)和升高[Ca2+]i的影响,应用L929细胞系和MTT法检测TNF-琢量,同时用激光共焦扫描显微术检测单细胞[Ca2+]i变化动力学。结果显示大黄素能轻度促进正常PM准释放TNF-琢,并发现大黄素诱发PM准[Ca2+]i变化呈振荡波模式。大黄素显著抑制LPS刺激PM准过度释放TNF-琢和升高[Ca2+]i,10-5mol/L大黄素抑制了10mg/LLPS刺激的TNF-琢峰值的50%和[Ca2+]i峰值的68%。LPS诱发PM准[Ca2+]i变化呈现高幅值的“平台期”,大黄素使之转变为低幅值的波动变化。以上结果说明,大黄素对PM准释放TNF-琢和升高[Ca2+]i表现出的双向调节作用之间有一定的相关性,大黄素对LPS诱发的[Ca2+]i升高的调制,可能是抑制LPS刺激PM准释放TNF-琢的信号传导通路中的重要环节。     

糖皮质激素快速抑制气道平滑肌游离钙升高与磷脂酶C活性的关系

目的:本实验通过对平滑肌细胞行GCs快速预处理,拟证实糖皮质激素对平滑肌细胞内[Ca2+]i浓度升高有快速抑制作用,并初步探讨该现象的可能分子机制。方法:原代培养的大鼠平滑肌细胞,应用Fura-2/AM显微荧光检测技术,检测肌细胞内[Ca2+]i在受到激动剂刺激后的浓度变化;比较不同浓度地塞米松预处理后10min与对照组之间游离钙上升情况的区别。用Western blot方法,分析气道平滑肌细胞内抑制型磷脂酶C(phospho-PLCβ-ser1105)含量的变化。设立RU486及CHX对照组,排除基因组作用在该反应中的影响。结果:GCs温浴10min,能够明显降低乙酰胆碱引起的ASMCs细胞内[Ca2+]i峰值。并能够明显上调ASMCs内抑制型PLC含量。这些反应不受RU486和CHX影响。结论:GCs能够通过非基因组作用快速抑制刺激物引起的气道平滑肌的收缩反应,这一效应的实现可能是通过抑制PLC分子活性,使其下游的[Ca2+]i浓度降低实现的。     

丹参酮ⅡA调节microRNA-1保护缺氧心肌细胞的作用研究

目的:研究丹参酮Ⅱ A(TanshinoneⅡA)通过调节microRNA-1抗心肌细胞缺氧损伤的作用。方法:原代培养新生大鼠心肌细胞,建立心肌细胞缺氧模型。MTT法检测心肌细胞存活率(%);TUNEL、流式细胞术测心肌细胞凋亡率;激光共聚焦检测心肌细胞内钙离子[Ca2+]i浓度的变化情况。结果:MTT结果显示丹参酮ⅡA对缺氧心肌细胞及过表达miR-1引起心肌细胞损伤具有保护作用。丹参酮ⅡA增加了缺氧心肌细胞的存活率(P0.05),同时给予丹参酮ⅡA和miR-1组与单独miR-1损伤组相比较,存活率也明显升高,呈现剂量依赖性。TUNEL结果显示丹参酮ⅡA可以抑制缺氧诱导的细胞凋亡,丹参酮ⅡA可以明显降低由缺氧导致的细胞凋亡率(P0.05)。共聚焦检测结果显示,缺氧损伤的心肌细胞内[Ca2+]i显著升高1322.72±5.16(vs正常对照组,P0.05),丹参酮ⅡA则有效抑制由缺氧引起过高的[Ca2+]i。miR-1诱导的细胞内[Ca2+]i升高至1349.33±62.63,约为正常对照组的1.96倍,而丹参酮ⅡA则有效抑制胞内过高的[Ca2+]i,从而发挥心肌保护作用。结论:丹参酮ⅡA可能是通过抑制胞内miR-1的表达,参与对钙离子浓度的调控,发挥其对心肌细胞的保护作用。     

肿瘤坏死因子-α诱导心肌肥大中CaN信号通路的作用

目的:研究钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导心肌细胞肥大中的作用。方法:Lowry法测心肌细胞蛋白含量;计算机图象分析系统测心肌细胞体积;[3H]-亮氨酸掺入法测心肌细胞蛋白合成;Till阳离子测定系统观察胞内[Ca2+]i瞬变;Western blot法测定CaN的表达。结果:①CaN特异性抑制剂CsA(0.2μmol/L)明显抑制TNF-α(100μg/L)诱导的心肌细胞蛋白含量、蛋白合成和细胞体积增大,但对正常心肌细胞生长无影响。②CaN特异性抑制剂CsA(0.2μmol/L)明显降低TNF-α诱导的心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)瞬变幅度增高。③TNF-α明显增强心肌细胞内CaN的表达。结论:TNF-α可能通过引起心肌细胞[Ca2+]i升高,促进CaN表达诱导心肌细胞肥大。     

共聚焦显微术测定大鼠和黄鼠心肌细胞游离Ca2+浓度与温度的关系

运用共聚焦激光扫描显微成像术对比研究非冬眠动物大鼠和冬眠动物黄鼠心肌细胞胞内Ca2+浓度 ([Ca2+]i) 随温度的变化.首先标定了不同温度下Ca2+探针indo-1的解离常数,提出并证明按α定态设定标定溶液pH值的必要性.细胞荧光分析显示,大鼠心肌细胞[Ca2+]i随温度降低显著上升,低温下频繁出现自发钙波,胞内发生钙超载;相比较冬眠动物黄鼠心肌细胞[Ca2+]i在相同条件下保持稳定,避免发生钙超载.认识其中的钙稳态机制可能对有关医学问题有潜在的指导意义.     

RANKL在成釉细胞瘤骨吸收机制中的作用

目的:检测RANKL在成釉细胞瘤(ameloblastoma,AM)组织中的表达情况及探讨RANKL在AM骨吸收机制中的作用.方法:通过免疫组化方法检测RANKL在AM组织中的表达情况;通过建立AM细胞/新生大鼠骨细胞共培养体系,观察AM细胞诱导破骨细胞形成的活性,再以OPG(RANKL的抑制剂)进行干预,观察OPG对AM细胞诱导破骨细胞形成活性的影响.结果:RANKL在AM组织中有恒定的表达;AM细胞能够诱导新生大鼠骨细胞分化为成熟的破骨细胞,但此活性可被OPG明显抑制.结论:AM细胞诱导破骨细胞形成可能是AM骨吸收过程中局部破骨细胞形成的重要来源和机制,而RANKL在此过程中发挥重要作用.     

肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞薄荷醇引起的胞浆游离Ca~(2+)浓度增加幅度减低

本文通过观察正常(control,CON)、慢性低氧(chronic hypoxia,CH)和野百合碱(monocrotaline,MCT)预处理肺高压大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)中,瞬时感受器电位M8(transient receptor potential melastatin8,TRPM8)通道特异激动剂薄荷醇(menthol,MT)引起的胞浆游离钙浓度([Ca2+]i)变化,探讨TRPM8通道在肺高压发病过程中的作用。大鼠处于CH环境或一次性腹腔注射MCT制备肺高压大鼠模型;原代培养CON和肺高压大鼠PASMCs,观察MT激动TRPM8通道引起的PASMCs[Ca2+]i变化,以及TRPM8通道特异阻断剂N-(4-叔-丁基苯基)-4-(3-氯吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酰胺[N-(4-tert-butylphenyl)-4-(3-chloropyridin-2-yl)piperazine-1-carboxamide,BCTC]对MT引起[Ca2+]i变化作用的抑制效应;免疫组化检测TRPM8的细胞定位。结果显示,在2 mmol/L Ca2+和无Ca2+台氏液中,MT都可以引起CON组PASMCs的[Ca2+]i增高,且这两种增高作用均可以被BCTC阻断;在2 mmol/L Ca2+和无Ca2+台氏液中,与CON组相比,CH组和MCT组MT引起PASMCs的[Ca2+]i增高幅度均显著减小。免疫组化细胞定位实验显示,PASMCs除胞核外其余部分均有TRPM8棕黄色阳性表达。以上结果提示,PASMCs上的TRPM8通道既存在于胞膜,也存在于肌浆网;CH和MCT预处理可以分别减少PASMCs上TRPM8通道介导的Ca2+内流与Ca2+释放。     

八肽胆囊收缩素激活钙离子通道和酪氨酸激酶诱导豚鼠心肌细胞内的游离钙增高

探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对豚鼠单个心肌细胞内游离钙浓度([Ca2+]i的影响及其信号转导机制.Fluo 3-AM标记酶消化法分离的单个心室肌细胞,用激光共聚焦显微镜测定细胞内[Ca2+]i的浓度.[Ca2+]i的变化用荧光强度(Fi)和相对荧光强度(Fi/F0%)表示.实验结果如下(1)在含Ca2+1.0 mmol/L的Tyrode's液中,CCK-8(1～104pmoVL)均可引起[Ca2+]i快速显著上升(P＜0.01).(2)用钙离子鳌合剂EGTA(3 mmol/L)和钙离子通道阻断剂nisoldipine(0.5μmol/L)预孵育心肌细胞5 min,CCK-8(102pmol/L)仅可引起[Ca2+]i缓慢轻度上升(P＜0.01).(3)用非选择性CCK受体拮抗剂丙谷胺(proglumide 6μmo1/L)或酪氨酸激酶抑制剂genistein(1 μmol/L)预孵育心肌细胞5 min,则完全抑制CCK-8诱导的[Ca2+]i升高(P＜0.01).CCK-8可通过激活其受体控制的Ca2+通道,引起Ca2+内流,诱导细胞内Ca2+释放,引起豚鼠单个心肌细胞内[Ca2+]i上升,此作用可能由酪氨酸激酶介导.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.