草鱼细胞融合及早熟凝集染色体的诱导

用聚乙二醇（PEG）诱导草鱼ZC-7901细胞株融合,测定了不同浓度的PEG诱导草鱼组胞的融合率,从而得出了PEG诱导草鱼细胞融合的适宜浓度为45%（W/W）。用45%PEG诱导间期细胞（I期细胞）与分裂期细胞（M期细胞）融合,早熟凝集染色体（PCC）的诱导率是18.85%。观察PCC形态,G1-PCC呈单股染色体纤维形;G2-PCC呈双股染色纤维形,较分裂期细胞染色体细长;S-PCC呈“粉末状”染色体片段。     

小鼠单个卵母细胞中18S rRNA基因表达研究

目的:探讨小鼠卵母细胞发育成熟与18S rRNA基因表达的关系。方法:根据Genbank中公布的小鼠18S rRNA保守区序列(363bp),用DNAclub软件设计两对特异性引物,RT-PCR检测单个GV、MⅠ期卵母细胞18S rRNA的表达;取单个MⅠ期卵母细胞二次PCR产物连接至pTG19-T载体、转化大肠杆菌感受态细胞,取阳性克隆进行测序。结果:RT-PCR检测显示18S rRNA基因在小鼠单个GV期、MⅠ期卵母细胞中均有表达,且在未成熟卵母细胞中,MⅠ期的表达明显强于GV期的表达。测序结果表明小鼠单个卵母细胞表达的18S rRNA基因与参考序列(Genbank NR_003278)完全一致。结论:小鼠MⅠ期之后的卵母细胞发育需要蛋白质的合成,卵母细胞的成熟可能与核糖体18S基因表达有关。     

S_(180)-V系细胞周期中cAMP,cGMP含量与细胞形态变化扫描电镜的观察

本实验用氚标记环磷酸腺苷(~3H-cAMP)及碘标记环一磷酸鸟苷(I~(125)-cAGP)的放射免疫法,测定了体外培养S_(180)-V系细胞周期中悬浮的M期细胞和其贴瓶细胞与均相细胞内cAMP及cGMP的含量,并对相应的细胞形态的变化做了扫描电镜观察。此外,对这三种群体细胞体积进行了测量,据此对这些细胞内cAMP及cGMP浓度进行了换算。实验结果表明:M期细胞体积的平均值接近其它时相细胞平均细胞体积的2倍,M期细胞的cAMP含量明显低于贴瓶细胞和均相细胞内cAMP含量,而cGMP含量略有提高,但差异不显著,但cAMP/cGMP比值与贴瓶细胞(非M期的其它时相细胞)及均相细胞(包括M期时相的混合细胞)相比,显著降低,相差2—3倍。用扫描电镜对上述测定的各类细胞组份进行了对应的观察,从其外形的变化表明,S_(180)-V系细胞的骨架系统很不发达,在cANP含量低的漂浮组(M期细胞)比贴瓶细胞的骨骼系统更不发达.     

过表达TPX2对人宫颈癌Hela细胞增殖和周期的影响及机制

该文的目的是研究过表达Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2,TPX2)对人宫颈癌Hela细胞体外增殖和细胞周期的影响及相关机制。构建TPX2过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)及阴性对照(LV11-NC),选取稳定感染过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)的Hela细胞作为实验组,将稳定感染(LV11-NC)的Hela细胞作为阴性对照组。未感染病毒的人宫颈癌Hela细胞作为空白对照组(CON)。CCK-8法及克隆形成实验检测各组Hela细胞体外增殖能力,FCM法检测各组Hela细胞的细胞周期分布变化。Western blot检测TPX2通路中Aurora A、eg5、P53蛋白质及增殖和细胞周期相关蛋白Ki67、CyclinB2、PCNA的水平。结果显示:与空白对照组及阴性对照组比较,LV11-TPX2感染组Hela细胞增殖能力明显增强(P0.05);LV11-TPX2组形成的克隆数目明显多于阴性对照组及空白对照组(P0.05)。LV11-TPX2组S期及G_2/M期细胞所占比例明显增加(P0.05)。LV11-TPX2感染组Hela细胞中Aurora A、eg5、Ki67、CyclinB2、PCNA蛋白质水平明显上调(P0.05),P53蛋白质明显下调(P0.05)。以上结果表明,TPX2基因过表达能促进宫颈癌细胞的增殖,S期及G_2/M期细胞所占比例明显增加,可能与其下调P53蛋白质水平及上调Aurora A、eg5、Ki67、CyclinB2、PCNA蛋白水平有关。     

玉米rRNA基因的组织和表达模式

玉米(Zea mays)只有1对45S rDNA位点并在分裂期染色体形成次缢痕, 是研究植物细胞rRNA基因组织和表达模式的简单模型。采用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)、CPD(PI与DAPI组合)染色和银染技术, 分析了玉米根尖分生细胞rRNA基因的组织和表达模式。45S rDNA探针在所有间期细胞核中显示2种杂交信号: 荧光强烈地位于核仁周边的纽, 而相对较弱地分布于核仁内的点。在部分细胞中可观察到点与纽相连或从纽发出; 点的数目越多, 纽变得越小; 点的数目多少与细胞的活性呈正相关。研究结果表明, 纽代表了处于凝缩状态的非活性的rDNA染色质, 纽解凝缩形成的点是rRNA基因活跃转录的细胞学表现; 不同阶段间期核的点的数目变化反映了被活化的rRNA基因数目不同。间期和前期细胞的CPD染色和相继的银染结果显示, 大部分rDNA染色质没有参与核仁的形成。rDNA FISH显示, 同一间期细胞的2个同源rDNA位点的表达水平存在差异, 同源染色体次缢痕的长度差异以及Ag-NOR和银染核仁的异态性进一步证实了这种差异的存在。FISH结果显示, 早中期细胞的rDNA染色质相对解凝缩, 银染在所有早中期细胞和部分中期细胞显示了明显的核仁, 表明玉米的rRNA基因在有丝分裂早中期有较活跃的转录, 其转录在晚中期才停止。     

双标记RC对KHT肉瘤的细胞周期分析(英文)

本文利用测定G_1期和中S期细胞内放射性变化的方法(RC)测出小鼠KHT肉瘤的细胞周期时相的时间及其变异系数(CV)。腹腔注射~3H-UdR后,8小时再注射~(125)I-UdR,按2小时间隔取肿瘤制成单个细胞悬液,DNA特异性染料色霉素A_3染色,根据细胞DNA含量用FACS荧光激活细胞分类器分离出纯的G_1期和中S期细胞,分别测定细胞中~(125)I和~3H的放射性,用多室数学模型根据每个细胞内~(125)I和~3H的放射性变化,计算出TG_1为6.7小时,Ts为9.0小时,TG2M为3小时,生长指数为1。     

小鼠肝核仁体外转录的研究

真核细胞基因的表达及其调控是当前分子 生物学领域中极为重要的研究课题之一,尤其 是特定基因的表达与调控更加引人注意。真核 细胞的核仁是核搪体装配的场所,它含有多拷 贝的特定基因— 核糖体RNA基因（rDNA) 和专门负责转录rDNA的RNA聚合酶I,唯 一的基因产物是rRNA。因此,核仁及其染色 质是研究特定基因转录及其调节控制的一个理 想系统。Busch 等〔141于1964年第一次证明离 体核仁能在体外系统中合成rRNA。其后,不少 工作者分别用鼠肝细胞^[7,15]、蛙卵母细胞^[8] 、四 膜虫细胞^[5],以及多种人工培养细胞(Novikoff 肝癌细胞、Hela细胞、Ehrlich 腹水癌细胞 等^[1][2]的核仁及其染色质对rRNA的体外合 成进行了研究。我们以小鼠肝核仁为材料,研 究核仁染色质的结构与功能,试图寻找与rRNA 体外合成有关的某种调控蛋白,以便阐明真核 细胞核糖体基因表达的调控机理。     

染色体提前凝集技术及其应用

染色体提前凝集(Premature Chromosome Condensation),简称PCC,是近十几年来在细胞融合和染色体技术的基础上发展起来的一种新技术。PCC的概念是Johnson和Rao于1970年根据其实验结果提出来的。他们认为,PCC就是分裂期细胞与间期细胞融合后,使间期核染色质提前在间期内凝集成染色体的现象。这种提前凝集的染色体称为PC染色体     

白屈菜红碱对宫颈癌细胞的抑制作用研究

目的:研究白屈菜红碱(chelerythrine,CHE)对宫颈癌细胞(Hela)的增殖抑制作用,为CHE在预防和治疗宫颈癌方面提供实验依据.方法:不同浓度CHE作用于体外培养的Hela细胞后,采用台盼蓝拒染法和噻唑蓝(MTT)法研究白屈莱红碱时宫颈癌(Hela)细胞增殖能力的影响,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期变化.结果:细胞接种密度越小、药物作用时间越长、药物浓度越大,CHE对Hela细胞的增殖抑制率越大,过大的细胞接种密度以及过低的药物浓度均不会引起明显的细胞死亡;CHE作用后的Hela细胞周期分布有明显变化,G1期细胞减少,S期和G2/M期细胞明显增多.结论:CHE在体外能明显抑制Hela细胞生长,其机理可能与CHE阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡有关.     

生长抑素对Hela细胞中Claudin-3和Claudin-4基因表达的调节作用

目的:探讨生长抑素对Hela细胞的生长调控作用以及对claudin-3和claudin-4基因的表达调控。方法:通过Hela细胞株培养,并以浓度为10-6、10-8、10-10和10-12 M的生长抑素(SST)作用于Hela细胞,未经药物处理的细胞设为对照组。在处理后采用流式细胞仪检测Hela细胞的凋亡。并采用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测claudin-3和claudin-4 m RNA和蛋白质表达量。结果:SST加入Hela细胞孵育12 h小时后,10-10 M、10-8 M和10-6 M浓度的SST对Hela细胞有显著性的诱导凋亡作用。不同浓度的SST作用于Hela细胞12 h后,claudin-3和claudin-4的m RNA和蛋白表达量都出现不同水平的增加。结论:在Hela细胞中SST可以促进claudin-3和claudin-4的基因表达,从而对宫颈癌的发展和扩散有抑制作用。     

间期核染色体期前凝聚现象的观察

通常真核细胞染色体仅见于有丝分裂或减数分裂时期。近年来,由于细胞融合技术的应用,在诱导中期细胞和间期细胞融合后,出现了间期核染色体凝聚现象——期前染色体凝聚(premature chromosome condensation即PCC)。期前凝聚染色体的形态特征随细胞融合时,间期核所处的时相而定。在含有中期核的多核细胞中,出现了不同形态的染色体凝聚现象。 自Johnson and Rao(1970)应用Harris等(1965)提出的细胞融合技术,成功的诱导     

小鼠内细胞团标志蛋白的性质、分离和纯化

我们用二相电泳方法在小鼠畸胎瘤系统中发现小鼠胚胎内细胞团标志蛋白双联体(分子量39,000,p14.4—4.5)也存在于未分化的胚胎癌细胞株(PSAI-NG2、F9、PCC3)中,但在已分化细胞株滋养层母细胞癌TDM1中用二相电泳方法不能检查到这蛋白。把EC细胞分为细胞质、细胞核、染色体三部分再进行检查,可以清楚地看到这蛋白主要存在于染色体部分。把染色体再分成0.35M NaCl可溶性,2M NaCl可溶性及2M NaCl不溶性三个组份时,则这蛋白出现在0.35M NaCl可溶性组分中,表明它是与染色体疏松结合的非组蛋白染色体蛋白。这蛋白是一种耐热性蛋白,在80℃受热10分钟不能使它变性。用制备型SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对经热处理的0.36M NaCl可溶性染色体蛋白进行分离,可得到电泳纯的小鼠内细胞团标志蛋白。由于这蛋白约占细胞总蛋白0.6%,与染色体疏松结合,又与早期胚胎细胞的多能性相关,提示它在维持多能细胞染色体构象方面有重要作用。     

小麦细胞核仁中rRNA基因转录的超微定位

真核细胞核仁中rRNA基因转录位点是长期以来未能解决的问题。以小麦细胞为研究材料,应用常规电子显微镜技术,观察了小麦细胞核仁纤维中心(Fibrillar centers,FC)内染色质的超微结构;并通过DNA抗体阐明了核仁中DNA位于纤维中心、致密纤维组分(Dense fibrillar component,DFC)以及两者的过渡区域;应用RNA聚合酶I相关转录因子UBF(Upstream binding factor)抗体所做的分析显示,小麦细胞核仁中UBF位于FC与DFC的过渡区域以及DFC中,在FC中没有UBF的存在;进一步借助于RNA/DNA杂合体抗体选择性地直接标记核仁中rRNA基因的转录位点,结果表明了小麦细胞核仁rRNA基因的转录位点是在FC与DFC的过渡区域及DFC中。     

中国仓鼠细胞和人胃腺癌细胞间期染色质凝聚的变化

染色体组在整个细胞周期中是连续存在 的。但在光镜下观察,绝大多数真核细胞的间 期核仅能见到网状的结构— 染色质,只有当 细胞进入有丝分裂期才出现凝聚和盘绕成棒状 的染色体。然而,运用体细胞融合技术使有丝 分裂的细胞和间期细胞相融合,将会导致间期 核的染色质凝聚为染色体样的结构。1970年 Johnson和Ra。将这一现象命名为熟前染色体 凝聚(premature chromosome condensation),简称 PCC^[5]。这种类似染色体的结构被称为成熟前 凝聚的染色体（prematurely condensed chromosome) 亦简称为PCC, PCC技术可使我们用光镜直 接观察间期染色体的形态变化。     

Hela细胞P16~(ink4)cDNA的克隆及序列分析

P16~(ink4)是CDK抑制蛋白,参与调控细胞G1期至S期的转换。目前发现P16`(ink4)基因损伤与多种肿瘤的发生、发展有关,可能是功能上非常重要的抑癌基因。为了研究该基因的功能,以及突变对该基因功能的影响,本文应用RT-PCR方法,从Hela细胞中克隆了P16~(ink4)cDNA。扩增得到556bp片段(包括引物两端酶切位点的16bp)克隆于M13载体,测定了其DNA序列。该序列包括了P16~(ink4)cDNA编码区全部471bp,以及3’端69bp序列。表明P16~(ink4)cDNA已成功地得到克隆。     

濒危植物巴东木莲花粉母细胞减数分裂观察

对巴东木莲Manglietia patungensis及其近缘种乳源木莲M. yuyuanensis的花粉母细胞减数分裂过程的基本特征进行了比较研究。乳源木莲与巴东木莲的染色体数目和核型相同,但不经任何人为因素诱导,它们之间在减数分裂过程中的染色体行为上有明显差异。(1)巴东木莲减数分裂中期I构型为0.30IV+18.33II+0.15I,与乳源木莲构型19II不同,巴东木莲可能存在同臂内倒位杂合子,染色体结构存在一定的杂合性。(2)后期I和后期II染色体行为异常现象发生频率明显不同。以后期II为例,乳源木莲减数分裂相中有迟滞染色体的细胞占8.8%,迟滞染色体不超过2个;巴东木莲有迟滞染色体等异常现象的细胞占29.2%,迟滞染色体最高达11个,还出现染色体碎裂成断片现象。巴东木莲减数分裂过程中染色体组表现出染色体结构杂合变异和迟滞染色体与染色体的断裂频率很高的异常现象在一定程度上可能影响了雄配子体的发育。     

45S rDNA基因的不稳定性及其与转录的相关性

45S rDNA基因由串联重复序列构成,是遗传不稳定性的热点区域,易于发生DNA断裂和重组。以Hela和CHO细胞系为研究对象,运用荧光原位杂交技术检测有丝分裂不同时期的45S rDNA基因的不稳定性表型。结果表明,位点特异性的染色体浓缩失败是其在中期染色体上不稳定性的主要表型。具有这种表型的染色体在后期可能会出现落后或粘连现象,甚至有可能引发断裂,形成卫星核。同时,免疫荧光双染色技术检测表明DNA双链断裂的标记蛋白(γH2AX)和RNA聚合酶I的上游结合因子(UBF)在有丝分裂的不同时期都存在共定位现象。该结果为探讨45S rDNA基因的不稳定性与转录的关系提供了直观的细胞学证据。     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis Cvirus)全长开放阅读框的质粒pBRTM／HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3．1(-)中。通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3．1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3．1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选。大约两周后,获得稳定表达的细胞株。经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达。在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3．1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50％,而转染pcDNA3．1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h。从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用。     

HCV 5A基因在Hela细胞中的稳定表达及对细胞生长的抑制现象

应用PCR技术从含有HCV(Hepatitis C virus)全长开放阅读框的质粒pBRTM/HCV 1-3011中获得NS5A全长基因片断,利用基因重组技术将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1(-)中.通过酶切、PCR及测序鉴定NS5A基因已正确插入到pcDNA3.1(-)中,再利用脂质体介导转染Hela细胞,48h后传代并利用pcDNA3.1(-)质粒上的neo抗性基因加入G-418进行筛选.大约两周后,获得稳定表达的细胞株.经RT-PCR及western blot验证,证实HCV的NS5A基因在Hela细胞中已经获得了表达.在培养条件完全一致的条件下,表达NS5A基因的Hela细胞与pcDNA3.1(-)转染的细胞相比,生长速度明显变慢,其倍增时间约为35-36h,比对照组细胞增加了约50%,而转染pcDNA3.1(-)的细胞的倍增时间与正常Hela细胞则无明显差别,都为23-24h.从而证明HCV的NS5A蛋白具有抑制Hela细胞生长的作用.     

多囊卵巢病人淋巴细胞的rRNA基因活性

人类的rRNA基因位于5对近端着丝点染色体短臂的次缢痕上。间期细胞中,该区域转录45S rRNA并聚集形成核仁,因此把该区域称为核仁形成区(NOR)。在中期染色体制片上,核仁形成区常常靠近,这种现象叫做随体联合。一般认为随体联合是间期细胞核仁的残余。