高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒感染性克隆的构建

目的 确定"猪高热综合征"的主要病原是否为猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),为探寻高致病性病毒基因组结构和功能、高致病性蓝耳病发病机制,以及进一步研制针对后者的基因工程疫苗奠定基础。方法 根据PRRSV基因组序列设计特异性引物,分5段扩增了高致病性PRRSV JX143株的全长cDNA,将各cDNA片段克隆到pBlueScriptⅡSK(+)载体中,进而利用重叠区中的单酶切位点将其连接成JX143株的全长cDNA克隆pJX143和含有遗传标记MluⅠ限制性内切酶的基因组全长cDNA克隆pJX143-M。结果全长cDNA克隆经体外合成RNA后转染MA-104细胞,均获得稳定的拯救病毒。通过比较亲本病毒与拯救病毒的病毒滴度、多步生长曲线和利用拯救病毒vJX143进行动物回归试验,结果 发现病毒学及生物学特性没有显著差异。结论 PRRSV的JX143株病毒确实是引起"猪高热综合征"的主要病原;建立了首个高致病性PRRSV的感染性cDNA克隆,证明拯救病毒与亲本病毒生物学特性相同。     

表达猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

表达猪圆环病毒II型ORF2基因的重组猪伪狂犬病病毒的免疫原性

摘要:【目的】为研制预防猪圆环病毒II型(PCV2)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗。【方法】将PCV2 ORF2基因插入到PRV通用载体pG中,利用脂质体LipofectamineTM 2000试剂盒将重组转移质粒pGO与猪PRV弱毒HB98株DNA共转染猪睾丸(ST)细胞,通过3轮蚀斑纯化重组病毒。将重组病毒、商品化PCV2灭活苗及DMEM培养液分别免疫6周龄雌性昆明小鼠,4周后加强免疫1次,首免后第8周用PCV2强毒NY株对小鼠进行攻毒。【结果】成功获得表达ORF2基因的重组病毒PGO,首免重组病毒后小 鼠体内抗PCV2的ELISA抗体水平很低,二免后小鼠PCV2特异的ELISA抗体水平明显升高,并且重组病毒组能够激发PCV2特异的淋巴细胞增殖效应。攻毒试验表明重组病毒组和PCV2灭活疫苗组均能有效抵抗PCV2强毒攻击。【结论】表明表达ORF2基因的重组病毒PGO具有良好免疫原性。     

型内嵌合口蹄疫病毒全长感染性cDNA克隆的构建

【目的】近年来,O型口蹄疫的不断暴发严重危害了我国畜牧业的发展,其病原——O型口蹄疫病毒已演化出3种谱系:中国型猪毒系、泛亚系和缅甸98系。其中中国型猪毒系病毒高度嗜猪,对养猪业危害最大。目前应用的疫苗已不能有效保护中国型猪毒系变异株的流行,这给我国猪口蹄疫的防控带来了极大的困难。为了进一步发展免疫原性好、抗原谱广的猪O型口蹄疫疫苗候选株,本研究以O/HN/93现用疫苗毒株的感染性克隆为骨架,用流行的新猪毒系病毒的部分VP3和VP1基因(主要是替换VP1蛋白上的B-C环和G-H环)替换疫苗毒株的相应部分,构建了嵌合的FMDV全长cDNA克隆。【方法】线化的嵌合全长质粒和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,体内转录拯救嵌合病毒。【结果】嵌合全长质粒转染BHK-21细胞36h后,出现明显的FMDV致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、间接免疫荧光、电子显微镜观察结果证实成功拯救到嵌合的FMDV。拯救的病毒乳鼠致病性试验结果表明该拯救病毒对乳鼠的致病力减弱。该嵌合病毒的成功拯救为研制口蹄疫新型疫苗等奠定了基础。     

表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特性分析

将猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）CH-1a株GP5基因插入到伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus,PRV）Bartha-K61株TK基因中,获得了一株TK^-／gE^-表型的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV—GP5。经生长动力学、表达动力学和间接免疫荧光证实PRRSV GP5在重组病毒中获得了表达,表达蛋白的抗原性与亲本病毒相似,rPRV-GP5在不同的细胞上毒价和细胞病变与Bartha—K61比较无显著差异。4只PRV抗体阴性的绵羊,每只接种10^6.0。PFU的rPRV-GP5可以完全抵抗10^3LD50伪狂犬病强毒S株的攻击。10头PRV、PRRSV抗体阴性的仔猪滴鼻接种rPRV-GP5 10^7.0 PFU／头并在接种后63d攻击PRRSV CH-1a株10^5.0 TCID50／头,攻毒后3d和5d出现了PRRSV荧光抗体和ELISA抗体,在政毒后14d检测到了PRRSV中和抗体,Bartha—K61活疫苗组和对照组至实验结束时仍未检测到PRRSV中和抗体。这说明rPRV-GP5免疫产生了针对PRRSV的回忆性免疫应答。     

猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗与重组腺病毒活载体疫苗联合免疫效果评价

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变;而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护,但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果,本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略,并在猪体上进行了评价。结果显示,所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体,用猪瘟强毒攻击后,pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化,攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA,而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。     

PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSV ORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。     

共表达猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒NJ-a株ORF4、ORF5与ORF6基因重组改良型痘苗病毒安卡拉株的构建

为探讨共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinerep roductive and respiratory syndrome Virus,PRRSV)保护性抗原基因的重组改良型痘苗病毒安卡拉株(Modified Vaccinia Virus Ankala,MVA)的免疫效力,将PRRSVNJ-a株ORF4、ORF5和ORF6基因插入转移载体pⅡLR中,获得了三基因共表达的转移载体pⅡLR-ORF5/ORF6/ORF4,通过同源重组的方法获得重组病毒rMVA-GP5/M/GP4。以lacZ为报告基因进行噬斑筛选和重组病毒纯化后,PCR方法证明ORF4、ORF5和ORF6成功的插入MVA基因组中;经Western blot检测与间接免疫荧光试验证实,重组病毒感染细胞能正确表达PRRSVGP4、GP5与M蛋白。用rMVA-GP5/M/GP4免疫6周龄Babl/C小鼠,首免后3周可检测到特异性PRRSV中和抗体,8周后中和抗体效价可达25,并能继续维持4周;淋巴细胞增殖试验结果表明,重组病毒免疫小鼠产生强烈的特异性细胞增殖反应。上述研究结果表明rMVA-GP5/M/GP4具有良好的免疫原性,可作为预防PRRS的候选疫苗进一步研究。     

H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性研究

目的 评价H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗的长期免疫原性。方法 制备含MF59佐剂的H7N9禽流感病毒裂解疫苗成品,放置于(6±2)℃环境下,取保存6、24和30个月后的疫苗,对小鼠进行免疫,以血凝抑制效价和微量中和抗体滴度来评估该疫苗的免疫原性。同时,用存放30个月的疫苗进行2次免疫后,对小鼠进行攻毒,观察MF59佐剂疫苗的免疫保护效应。结果 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗在(6±2)℃保存30个月后免疫小鼠,检测其血凝抑制抗体效价和微量中和抗体滴度均没有明显的变化,且免疫小鼠能够有效抵御H7N9病毒的感染及其致病效应。结论 H7N9禽流感病毒裂解佐剂(MF59)疫苗具有良好的免疫原性,在(6±2)℃至少可保存30个月。     

PRRSV NJ-a株ORF5基因A表位的修饰与糖基化位点的突变对其DNA疫苗免疫效力的影响

为了提高PRRSVORF5基因的免疫效力,对ORF5基因进行了改造,将CpG序列和通用型辅助性T淋巴细胞表位插入A表位与B表位之间,并对N33与N51位糖基化位点进行了点突变,获得改造的ORF5基因。在此基础上构建了由两个CMV启动子调控的共表达改造的ORF5(MORF5)与ORF6基因的真核表达质粒pcDNA-M5A-6A。经Western-blot与IFA验证真核质粒的体外表达后,免疫6周龄Balb/c小鼠,利用微量中和试验检测免疫后的中和抗体,利用MTT法检测免疫后淋巴细胞的增生情况,并与未改造ORF5基因真核表达质粒pcDNA-5A-6A、弱毒疫苗以及灭活疫苗的免疫效果进行比较。结果表明,pcDNA-M5A-6A不但能够刺激免疫小鼠在较短的时间内产生更高水平的中和抗体,而且可以诱导产生更强烈的T淋巴细胞增殖反应。所构建的共表达PRRSV改造的ORF5基因与ORF6基因的DNA疫苗pcDNA-M5A-6A,能够较好的诱发小鼠产生较高的特异性针对PRRSV的中和抗体和细胞免疫应答,为研究能够更好地防制PRRSV的新型疫苗提供了新的思路。     

壳聚糖酶的克隆表达与壳寡糖的制备分析

目的:克隆壳聚糖酶基因于大肠杆菌中实现高表达,制备壳寡糖。方法:以枯草芽孢杆菌总DNA为模板扩增壳聚糖酶基因(CSN),克隆至载体pET23a(+)上,转化菌株BL21(DE3)。重组子经0.5 mmol/L IPTG诱导后,SDS-PAGE和质谱检测与鉴定重组酶。酶纯化后水解壳聚糖,薄层色谱分析其水解产物。结果:质谱证明壳聚糖酶(31.5kDa)成功表达,表达量占菌体总蛋白的45%左右。纯化后重组酶浓度为900 mg/L,纯度95%、回收率85%,酶活力为10 000 U/mg。壳聚糖降解产物为壳二糖至壳四糖。结论:原核表达载体pET23a(+)-CSN构建正确,壳聚糖酶表达量与活性高,适用于水解壳聚糖制备壳寡糖。     

国内外蝗害治理技术现状与展望

本文首先概述了国内外蝗虫发生与为害的态势,总结了现阶段我国蝗虫发生与为害的主要特点:即农田飞蝗暴发频繁而且严重,草原土蝗的发生时常造成严重的经济损失,而且侵入城市干扰市民生活,我国与周边国家之间蝗虫过境迁移频繁,使用化学农药污染环境和农产品;分析了国内外蝗虫防治对策与技术的发展现状,重点介绍了应急防治和可持续治理对策、...     

放牧对牧草光合作用、呼吸作用和氮、碳吸收与转运的影响

研究放牧对草地植物生理活动的影响,对于揭示草地放牧演替的生理机制有重要意义.大量研究表明,家畜放牧对牧草光合作用、呼吸作用以及C和N吸收与转运的影响,可以分为生理伤害和生理恢复2个阶段.放牧通过改变草地冠层结构影响牧草光合作用,净光合作用速率短期内迅速下降,随着叶面积指数增加又逐渐上升,呼吸作用有相似的变化趋势.牧草放牧后再生长所需的C和N最初主要来自根系和留茬中的贮藏物质,此后随着牧草生长恢复逐渐由同化作用供给,C代谢与土壤N水平负相关.放牧后牧草生理活动变化与牧草遗传特性、种间竞争、家畜放牧特征、非生物环境等因素密切相关.     

Kinetics and thermodynamics of peroxidase- and laccase-catalyzed oxidation of N-substituted phenothiazines and phenoxazines

N -substituted phenothiazines (PTs) and phenoxazines (POs) catalyzed by fungal Coprinus cinereus peroxidase and Polyporus pinsitus laccase were investigated at pH 4–10. In the case of peroxidase, an apparent bimolecular rate constant (expressed as k _cat/K _m) varied from 1 ×10⁷M⁻¹s⁻¹to 2.6×10⁸M⁻¹s⁻¹ at pH 7.0. The constants for PO oxidation were higher in comparison to PT. pH dependence revealed two or three ionizable groups with pK _a values of 4.9–5.7 and 7.7–9.7 that significantly affected the activity of peroxidase. Single-turnover experiments showed that the limiting step of PT oxidation was reduction of compound II and second-order rate constants were obtained which were consistent with the constants at steady-state conditions. Laccase-catalyzed PT and PO oxidation rates were lower; apparent bimolecular rate constants varied from 1.8×10⁵M⁻¹s⁻¹ to 2.0×10⁷M⁻¹s⁻¹ at pH 5.3. PO constants were higher in comparison to PT, as was the case with peroxidase. The dependence of the apparent bimolecular constants of compound II or copper type 1 reduction, in the case of peroxidase or laccase, respectively, was analyzed in the framework of the Marcus outer-sphere electron-transfer theory. Peroxidase-catalyzed reactions with PT, as well as PO, fitted the same hyperbolic dependence with a maximal oxidation rate of 1.6×10⁸M⁻¹s⁻¹ and a reorganization energy of 0.30 eV. The respective parameters for laccase were 5.0×10⁷M⁻¹s⁻¹ and 0.29 eV. Received: 20 September 1999 / Accepted: 24 February 2000     

Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfolding of the superhelix and alpha-helices of myosin

The nanomechanical properties of the coiled-coils of myosin are fundamentally important in understanding muscle assembly and contraction. Force spectra of single molecules of double-headed myosin, single-headed myosin, and coiled-coil tail fragments were acquired with an atomic force microscope and displayed characteristic triphasic force-distance responses to stretch: a rise phase (R) and a plateau phase (P) and an exponential phase (E). The R and P phases arise mainly from the stretching of the coiled-coils, with the hinge region being the main contributor to the rise phase at low force. Only the E phase was analyzable by the worm-like chain model of polymer elasticity. Restrained molecular mechanics simulations on an existing x-ray structure of scallop S2 yielded force spectra with either two or three phases, depending on the mode of stretch. It revealed that coiled-coil chains separate completely near the end of the P phase and the stretching of the unfolded chains gives rise to the E phase. Extensive conformational searching yielded a P phase force near 40 pN that agreed well with the experimental value. We suggest that the flexible and elastic S2 region, particularly the hinge region, may undergo force-induced unfolding and extend reversibly during actomyosin powerstroke.     

白术同源四倍体的诱导和鉴定及其与二倍体过氧化物酶的比较

以白术（Atractylodes macrooephala Koidz.）二倍体组培苗为材料,对其四倍体诱导方法进行研究,共获得45个白术同源四倍体株系,为优良株系的选育提供了材料。此外,还分析比较了其中8个白术四倍体株系与二倍体的过氧化物酶同工酶（POD）的酶谱差异,发现四倍体各株系过氧化物酶同工酶谱比二倍体的均多了Rf0.310的谱带,且总过氧化物酶比活力也发生了很大改变,对探讨白术四倍体优良株系的生理生化机理具有一定的参考价值。     

颧骨颧弓骨折的分类及诊治

颧骨颧弓骨折是最常见的面中部骨折之一,迄今为止,在其分类及诊治的选择上仍然存在一定争议,本文对目前颧骨颧弓骨折的分类及诊治的现状和进展作一综述,以期对临床工作提供参考。