表达猪瘟病毒E2蛋白的BacMam病毒的构建及其免疫原性分析

含具有哺乳动物细胞活性的启动子的重组杆状病毒(BacMam病毒)可有效转导多种哺乳动物细胞,并被广泛用于开发新型非复制型载体疫苗．将水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)基因插入多角体启动子下游,得到经修饰的杆状病毒转移载体,将对虾白斑综合症病毒(WSSV)ie1启动子控制下的猪瘟病毒E2基因表达盒插入此载体中,构建了BacMam病毒BacMam/G-ie1-E2,以其感染Sf9细胞和转导HeLa细胞,通过间接免疫荧光试验和Western blot分析检测E蛋白的表达,同时用BacMam病毒直接免疫小鼠,用检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体,用基于CFSE和WST-8的淋巴细胞增殖试验评价其细胞免疫应答．结果显示,BacMam/G-ie1-E2能同时在昆虫细胞和哺乳动物细胞中高效表达E2蛋白,免疫小鼠能诱导产生针对猪瘟病毒的特异性抗体,免疫小鼠脾细胞经猪瘟病毒刺激后能诱导特异性的淋巴细胞增殖．这表明,由BacMam病毒介导的基因转移有望用于开发针对猪瘟病毒的非复制型载体疫苗．     

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒的构建及其在兔体内的免疫原性分析

为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2.测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱毒疫苗株(c株)进行攻击,攻毒后3 d取其脾脏,用实时荧光定量RT-PCR检测C株病毒RNA.结果表明,该重组腺病毒传至第10代时,毒价可达1.0×1010TCID<,50/mL;外源基因可在其中得到稳定表达;rAdV-E2接种兔免疫后2周产生猪瘟特异性抗体,免疫后5 W抗体达到峰值,攻毒后rAdV-E2接种兔和C株接种兔均未出现定型热反应,从其脾脏也未检测到C株病毒RNA,而野生型腺病毒接种兔均出现了定型热反应,并且从其脾脏检测大量C株病毒RNA,其含量达到了103拷贝/μL以上.由此表明,rAdV-E2可望开发为猪瘟候选疫苗.     

猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗与重组腺病毒活载体疫苗联合免疫效果评价

本实验室先前分别将构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒疫苗(rAdV-E2)和猪瘟甲病毒复制子载体DNA疫苗(pSFV1CS-E2)在猪体上进行了免疫效力评价,结果显示,rAdV-E2免疫组所有猪虽然在加强免疫后产生了比较高的猪瘟特异性中和抗体,但攻毒后个别猪表现短期体温升高和轻微病变;而pSFV1CS-E2免疫组猪只虽然在攻毒后得到了保护,但产生的抗体水平较低。为了增强猪瘟甲病毒复制子载体疫苗和猪瘟重组腺病毒活载体疫苗的免疫效果,本研究应用了复制子载体DNA疫苗初免和重组腺病毒疫苗加强免疫的初免-加强(Prime-boost)免疫策略,并在猪体上进行了评价。结果显示,所有免疫猪均产生了高水平的猪瘟特异性的中和抗体,用猪瘟强毒攻击后,pSFV1CS-E2初免组所有猪(n=5)均没有出现任何猪瘟的临床症状和病理变化,攻毒后在猪血液中也没有检测到猪瘟病毒RNA,而重组腺病毒初免组(n=5)有一头猪出现短期发热和病毒血症及轻微病理变化。这表明初免-加强免疫策略能显著提高重组疫苗的免疫效力。