天然来源α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选方法的研究进展

α-葡萄糖苷酶抑制剂(alpha-glucosidase inhibitors,AGI)是一类通过延缓肠道内碳水化合物的水解和吸收从而到达有效控制餐后血糖上升的糖尿病治疗药物,具有控制餐后血糖、保护胰岛细胞功能及改善多种糖尿病并发症等作用。近10年来,α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选方法由传统的筛选模型迅速发展到多种新技术的应用,各种新型筛选模型不断发展应用,从天然资源中寻找新的α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为现如今防治糖尿病的研究热点。本文对α-葡萄糖苷酶抑制剂的降糖机制及作用特点、从天然资源中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的模型和方法等内容进行整理和归纳,重点对近10年来国内外从天然资源中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂的新型筛选模型和方法进行总结和比较,探讨各类方法的特点、存在的问题以及研究思路,为寻找和发现天然α-葡萄糖苷酶抑制剂提供基础。     

条斑紫菜蛋白酶解产物中α-葡萄糖苷酶抑制剂纯化及特性

以α-葡萄糖苷酶抑制活性为指标,优选出1398中性蛋白酶、碱性蛋白酶和氨肽酶在一定条件下复配酶解条斑紫菜蛋白制备α-葡萄糖苷酶抑制剂。酶解液加入乙醇至终浓度为60%以沉淀去除多糖,上清液为α-葡萄糖苷酶抑制剂粗品。该粗品利用SP Sepharose High Performance阳离子交换层析、Sephadex G-10凝胶层析和Mono Q阴离子交换层析进行分离纯化,获得一种肽类α-葡萄糖苷酶抑制剂(LGI)。LGI经反向高效液相层析测定纯度为62.4%,基本特性分析显示其具较好的温度和pH稳定性,对α-葡萄糖苷酶半抑制浓度IC50值为97.36μg/mL,属于一种非竞争性抑制剂。     

中药提取物中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选

目的：从中药中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法：采用α-葡萄糖苷酶、淀粉酶以及蔗糖酶活性测定方法,对126种经水煮醇沉提取的常用中药进行α-葡萄糖苷酶抑制活性筛选。结果：在0．28mg／ml反应体系下,24种中药提取物显著抑制α-葡萄糖苷酶活性;在0．1mg／ml反应体系下,5种中药提取物抑制α-淀粉酶活性。大黄、山茱萸、赤芍、五倍子对α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶以及转化酶活性均有抑制作用,与阳性药物拜唐苹比较,这4种中药抑制α-淀粉酶的活性较低,但抑制α-葡萄糖计酶和转化酶的活性明显强于拜唐苹。结论：某些中药提取物能显著抑制α-葡萄糖苷酶活性,如果对其进一步分离、纯化并提取活性部位,可望获得抑制活性更强的中药α-葡萄糖苷酶抑制剂。     

螺旋藻中α-葡萄糖苷酶抑制剂的提取及动力学

研究与开发了钝顶螺旋藻中的α-葡萄糖苷酶抑制剂。采用氯仿-甲醇溶液浸提、大孔吸附树脂脱色、硅胶层析柱,Saphedex LH-20柱层析等步骤分离纯化得到α-葡萄糖苷酶抑制剂;利用紫外及红外图谱分析了所提抑制剂结构;采用双倒数作图法研究其抑制动力学特性。从螺旋藻分离的α-葡萄糖苷酶抑制剂达到了色谱纯,通过多种色谱分析,推测该试样为带有共轭体系的多羟基酯类化合物。对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制效果,抑制剂质量浓度为0.18 g/L时,抑制率达73%;动力学研究表明为典型的非竞争性抑制,为进一步的研究与开发奠定了基础。     

α-葡萄糖苷酶抑制剂HW110产生菌的研究

目的:筛选新的α-葡萄糖苷酶抑制剂。方法:采用α-淀粉酶及蔗糖酶抑制试验,从2000株放线菌发酵液中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂。结果:从淡紫灰链霉菌HW110(Streptomyces lavedulae HW110)发酵液中分离到HW110,其抑酶活性与acarbose相当。结论:利用α-淀粉酶及蔗糖酶抑制试验筛选到deoxynorjirimycin。     

高效液相色谱法测定灰兜巴对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

研究灰兜巴醇提石油醚萃取、醇提乙酸乙酯萃取、醇提正丁醇萃取、醇提萃取剩余部分和水提部分对于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,并通过高效液相色谱检测在药物与酶反应过程中振荡对于α-葡萄糖苷酶抑制率的影响。结果显示,灰兜巴各提取部分均表现出良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,为一种良好的α-葡萄糖苷酶抑制剂,且振荡对其抑制率的影响较大,在反应过程中应使酶与药物充分结合。     

微生物来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型的建立和初步应用

本研究用昆明种小鼠十二指肠上段提取的α-葡萄糖苷酶,以4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷为反应底物,建立α-葡萄糖苷酶抑制剂高通量筛选模型。用该模型对1276株放线菌和132株细菌等共计2224个发酵液粗提物样品进行筛选。初筛得到抑制率超过50%的阳性样品23个,初筛阳性率为1.03%。将阳性菌株再次进行发酵提取,得到新发酵液的阳性样品数为17,复筛阳性率为0.74%。其中细菌3株,放线菌13株。3个阳性样品经α-葡萄糖苷酶验证后的抑制率均在75%以上。本研究建立的α-糖苷酶抑制剂高通量筛选模型具有很强的实用价值,可用于新型糖尿病药物的开发。     

石韦不同极性萃取物体外降血糖活性研究北大核心CSCD

为进一步明确石韦对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用机制,该研究以石韦95%乙醇提取物的不同极性萃取物为试材,阿卡波糖为阳性对照,采用pNPG法(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG)、DNS法(3,5-dinitro salicylic acid,DNS)考察石韦不同极性萃取物的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,并采用酶促动力学方法与Lineweaver-Burk曲线分析最强活性萃取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用类型,以期为石韦的进一步开发利用提供科学依据。结果表明:石韦水萃取物对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制作用最强,其IC_(50)值分别为(4.71±0.72)μg·mL^(-1)、IC_(50)=(48.40±0.32)μg·mL^(-1),并显著强于其他萃取物(P<0.05),且对α-葡萄糖苷酶抑制作用比阿卡波糖强,对α-淀粉酶抑制作用弱于阿卡波糖。阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制作用的IC_(50)值分别为(2857.36±1.35)μg·mL^(-1)和(16.41±0.63)μg·mL^(-1)。酶促动力学显示水萃取物对α-葡萄糖苷酶为可逆性抑制,Lineweaver-Burk曲线显示为竞争性抑制。综上结果表明,石韦水萃取物具有较好的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性,是一种胃肠道副作用小、天然α-葡萄糖苷酶抑制剂来源。     

α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离纯化及其性质研究

目的：从中药中筛选α－葡萄糖苷酶抑制剂。方法：采用水浸提、活性炭脱色、离子交换树脂交替层析、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００柱层析等步骤分离纯化,结果：得到α－葡萄糖苷酸抑制剂ＨＧ１,其热稳定性好,ＰＨ适应范围广,分子量约在１４万以上,获得的ＨＣＩ对α－葡萄糖苷酶有很强的抑制作用,属非竞争性抑制,Ｋｉ＝６．０ｍｇ／Ｌ。结论：其作用特点有别于多数已有的α－葡萄糖苷酶抑制剂。     

不同成熟度树葡萄果实醇提取物抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性研究

为探究树葡萄果皮和种籽的抗氧化和对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,采用比色法测定了不同成熟度树葡萄果皮和种籽70%乙醇提取物的总多酚和总黄酮含量,并分析了他们与抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的相关性。结果表明,绿果皮的总多酚含量最高(95.96 mg g~(-1) DW),红果皮的最低(18.31 mg g~(-1) DW);绿果籽的总黄酮含量最高(43.48 mg g~(-1) DW),紫果籽的最低(16.50 mg g~(-1) DW);抗氧化活性及对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均以绿果皮的最强,紫果籽的最弱。树葡萄果皮/籽清除·OH自由基能力均高于抗坏血酸,对α-葡萄糖苷酶活性抑制作用均强于阿卡波糖;其总多酚和总黄酮含量与抗氧化能力显著正相关(P0.05),抗氧化能力与对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈显著正相关(P0.05)。因此,树葡萄绿果的总多酚及总黄酮含量较高,抗氧化活性、对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用较强,可用于天然抗氧化剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发。     

黄连中α-葡萄糖苷酶抑制剂的筛选分离及质谱分析

为筛选黄连中α-葡萄糖苷酶抑制剂,本研究采用高效液相色谱-电喷雾质谱联用技术(HPLC-DAD-MS)对黄连提取物中的化学成分进行分析鉴定,并采用高速逆流色谱分离其中的活性成分。选用反相C18色谱柱,以0.02%醋酸溶液(A)和甲醇(B)为流动相,进行梯度洗脱;利用电喷雾质谱(ESI-MS)正离子模式在线检测化学成分;以α-葡萄糖苷酶作为生物靶分子,以超滤质谱技术筛选酶抑制剂。再经高速逆流色谱分离纯化,以乙酸乙酯-正丁醇-乙醇-水(3.0∶1.7∶0.5∶6.0,v/v/v/v)为两相溶剂系统,所得分离收集液经高效液相色谱法检测。实验通过HPLC-DAD-MS共鉴定出5个化学成分,分别为药根碱、表小檗碱、黄连碱、巴马亭和小檗碱。通过HSCCC分离得到两种α-葡萄糖苷酶抑制剂巴马亭和小檗碱。利用液相色谱-超滤-质谱-高速逆流色谱联用技术可以快速分离鉴定黄连中的化合物。此方法对于筛选有效成分具有快速和灵敏等优势。     

两种α-糖苷酶抑制剂体外筛选模型的改良与比较

α-糖苷酶抑制剂可以控制餐后血糖浓度波动,从而达到预防和治疗糖尿病的作用。本文对两种α-糖苷酶抑制剂体外筛选模型进行了改进。结果表明,以阿卡波糖作阳性对照,两种模型均适用于以脱脂乳为生长介质的产α-糖苷酶抑制剂的乳酸菌的筛选。选取12株特定乳酸菌分别用两种模型测其发酵脱脂乳上清对α-糖苷酶的抑制活性,两种模型筛选结果一致,但测得的抑制活性呈现一定的差异。当加入到脱脂乳中的阿卡波糖浓度较低时,以麦芽糖为底物的酶-抑制剂模型测得的α-糖苷酶抑制活性高于以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)为底物的酶-抑制剂模型。     

基于分子对接及酶抑制动力学探究红景天提取物体外α-葡萄糖苷酶抑制活性CSCD

为探究红景天提取物体外α-葡萄糖苷酶抑制活性及具有抑制作用的主要活性物质。该研究首先构建体外α-葡萄糖苷酶抑制体系,测定其抑制活性,通过酶抑制动力学判断抑制类型,然后采用UHPLC-QE-MS、分子对接进一步探索提取物中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性物质。结果表明,红景天提取物对α-葡萄糖苷酶具有较好的抑制效果,IC_(50)为1.538 mg/mL,抑制类型为竞争与非竞争性混合可逆抑制;UHPLC-QE-MS共检测出1245种化合物,其中脂肪酸类、萜类及其衍生物、黄酮及类黄酮类为化合物最多的3类,分别有107种、85种、66种,其次还鉴定出酚类、氨基酸类、糖类等多类物质;分子对接显示,20种相对含量较高的化合物中11种可与α-葡萄糖苷酶结合,(+)-表儿茶素结合能(-17.08 kJ/mol)最低、结合活性最佳,咖啡酸形成氢键最多为5个,分别与His-515、Arg-437、Glu-432、His-348残基相连,咖啡酸、L-苹果酸、槲皮素和酪醇具有相同结合位点Arg-437。研究旨为天然α-葡萄糖苷酶抑制剂的开发以及红景天资源利用提供了基础研究。     

藏药材诃子中3种α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离与鉴定

通过超滤-高效液相色谱法筛选诃子提取物中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的化合物,采用大孔吸附树脂和半制备高效液相色谱对其进行富集和分离制备,~1H NMR和~(13)C NMR鉴定其化学结构,最后采用以4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)为底物的酶抑制剂筛选模型检测目标化合物的活性。结果显示:诃子提取物中含有的3个主要成分具有潜在的α-葡萄糖苷酶抑制活性;经筛选,AB-8大孔树脂对目标化合物富集效果最好,富集后目标化合物的峰面积比分别达到29.6%、40.3%和21.9%;由半制备高效液相色谱对目标化合物进一步纯化后,得到纯度分别为96.6%、98.1%和96.4%的化合物1(27 mg)、2(35 mg)和3(22 mg);经~1H NMR和~(13)C NMR鉴定得出3个化合物分别为诃黎勒酸、诃子酸、鞣花酸;活性测试结果表明,3个化合物均具有良好的α-葡萄糖苷酶抑制作用,其中诃黎勒酸(IC_(50)=39.2±0.7 mg/L)和诃子酸(IC_(50)=35.8±0.4 mg/L)抑制活性大于阳性对照阿卡波糖(IC_(50)=41.2±0.6 mg/L)。本试验为开发诃子中的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供了科学依据。     

以α-葡萄糖苷酶活性抑制率为指标优化山茱萸果肉的提取条件

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉是三大名贵木本药材之一[1].新鲜山茱萸果肉中含有单糖、多糖、有机酸、苷类、环烯醚萜类、黄酮、蒽醌、甾体和内酯等成分[2],临床上多用山萸肉和酒山萸肉;山茱萸是常用的降血糖药物[3],常出现在中医降血糖的组方中.现代药理研究结果表明:山茱萸所含的糖蛋白、熊果酸、齐墩果酸、多糖、苷类、鞣质和环烯醚萜类等成分都具有降血糖效果[4-11].α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制小肠黏膜刷状缘α-葡萄糖苷酶对食物中淀粉和糖类的降解,延迟并减少葡萄糖的吸收,从而降低餐后血糖;目前常用的此类降糖药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇,但价格高、副反应和毒副作用较大,因此从天然动植物和矿物中寻找低毒、高效的α-葡萄糖苷酶抑制剂具有广阔的应用前景.     

构树皮中具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的成分

本文报道构树皮中α-葡萄糖苷酶抑制剂的分离鉴定。构树皮的乙醇浸膏通过溶剂萃取以及各种柱层析方法分离纯化得到6个化合物,通过波谱学方法鉴定为:broussonetine A(1),broussonetinine A(2),brous-sonetinine B(3),黑立脂素苷(liriodendrin)(4),butyrospermyl acetate(5)以及胡萝卜苷(6)。所有化合物均首次从构树中分离得到,其中1~3具有较强抑制α-葡萄糖苷酶的活性,IC50有分别为0.530、0.445和0.460mg/mL。     

家蚕α-糖苷酶抑制剂的分离及其性质

从家蚕中分离到对α-葡萄糖苷酶具有较强抑制活性的物质SCS,该α-葡萄糖苷酶具有促进多糖转化为容易吸收的单糖的作用。采用水浸提和离子交换树脂交替层析等方法,从冻干的全蚕粉中获得SCS,得率为2.7%。SCS对热稳定性好(37～100℃),pH适应范围广(5.0～9.0)。SCS对α-葡萄糖苷酶的抑制作用与“拜糖平”的抑制效果没有显著差异;其性质属竞争性抑制,不同与其它主要的α-糖苷酶抑制剂。另外,口服“拜糖平”(1.5g/kg)和SCS(1.5g/kg)都能显著地降低因四氧嘧啶诱导的高血糖小鼠的血糖值。研究结果表明,SCS通过抑制小肠中碳水化合物的吸收,起到降血糖作用,可开发应用于减轻非胰岛素依赖型糖尿病人的痛苦。     

小花杜鹃中两个新的木脂素

研究小花杜鹃(Rhododendron minutiflorum)的化学成分及其α-葡萄糖苷酶抑制活性。采用正相硅胶、ODS、Sephadex LH-20和HPLC等多种色谱技术,从小花杜鹃的95%乙醇提取物中分离得到9个化合物,通过波谱分析和文献数据对比,鉴定其结构分别为rhodominutinan A(1)、rhodominutinan B(2)、3,4-di(4-hydroxy-3-methoxybenzyl)tetrahydrofuran(3)、venkatasin(4)、苔色酸甲酯(5)、苔黑酚羧酸乙酯(6)、2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸甲酯(7)、芹菜素(8)、山奈酚(9)。其中化合物1和2为新的木脂素,化合物3~9为首次从小花杜鹃中分离得到。通过α-葡萄糖苷酶抑制剂体外筛选模型评价化合物的潜在降血糖活性,结果表明化合物8和9具有较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,IC₅₀值分别为57.51±6.35、54.70±3.67μM。     

一株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的牛类芽孢杆菌BD3526

为拓宽α-葡萄糖苷酶抑制剂的微生物来源,筛选一株具有降糖效果的菌株。实验利用体外模型对西藏生牦牛乳来源的菌株进行初筛和复筛,获得一株具有α-葡萄糖苷酶高抑制活性的类芽孢杆菌Paenibacillus bovis BD3526,该菌株的降糖活性(>60%)显著高于其他分离菌株和常规乳酸菌。菌株产α-GI的遗传性状稳定有效,中温、好氧发酵更有利于该菌株合成与积累活性物质。当在脱脂乳中发酵12h后,活菌总数达到峰值1.75×10^9CFU/mL,6h后的发酵乳的糖苷酶抑制活性均处于高水平(>80%),不断递减的IC50表明,α-GI伴随着发酵程度的加深在进一步积累。     

昆仑雪菊提取物对α- 葡萄糖苷酶的抑制作用

目的:探讨昆仑雪菊提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。方法:将昆仑雪菊干燥花序粉碎,分别用水提法和乙醇法制备5种提取物。采用α-葡萄糖苷酶体外活性抑制模型,测定昆仑雪菊的5种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。结果:这5种提取物对α-葡萄糖苷酶活性有较强的抑制作用,抑制活性均高于阿卡波糖。其中提取物Ⅰ的抑制活性最强,IC50=28.2 mg/L。结论:昆仑雪菊提取物具有较高的α-葡萄糖苷酶抑制活性,提示昆仑雪菊在抗糖尿病产品开发方面具有很好的应用前景。