SV40 TAg转基因小鼠模型的建立及其表达

为了建立中枢神经系统肿瘤小鼠模型,构建了大鼠神经元特异性烯醇化酶(ratneu-ron-specificenolase,NSE)基因启动子调控下的猿猴病毒40大T抗原基因(simianvirus40largeTantigengene,SV40TAg)转基因载体,通过受精卵雄原核显微注射的方法制备转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠的基因型;RT-PCR和Northern印迹检测转基因阳性鼠中SV40TAgRNA水平的表达及其组织特异性;免疫组化检测其蛋白质水平的表达。经显微注射共获得9只首代转基因阳性鼠(首建者,Founder小鼠),其中2例出生时即发生神经干细胞来源的肿瘤,其他Founder小鼠经繁育后共建立了5个SV40TAg转基因小鼠系,其中有4个系检测到SV40TAgRNA水平的表达且特异性地表达于脑组织,但未检测到蛋白质水平的表达。研究表明NSE启动子活性具有较强的组织特异性,并起始于小鼠胚胎发育期;SV40TAg具有明显的致癌作用,且SV40TAg诱发的神经系统肿瘤易造成转基因小鼠早期死亡。     

抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器的制备与验证

目的:构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体并制备和验证抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型。方法:利用PCR法扩增出抗人p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L,然后分别将嵌合抗体重链基因H和嵌合抗体轻链基因L连接到乳腺特异性表达质粒pBC1,从而构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L。分别将抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26乳腺特异表达载体pBC1-H和pBC1-L线性化,然后使用原核显微共注射法获得8只转基因FVB小鼠,通过鼠尾直接PCR鉴定其转基因阳性。通过RT-PCR、荧光定量PCR鉴定转基因小鼠乳腺组织中抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达。使用小鼠乳汁采集器收集其乳汁并通过Western blot和夹心ELISA等实验鉴定抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26是否获得表达。结果:经测序验证,抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L分别与乳腺特异表达质粒pBC1正确正向连接。鼠尾直接PCR结果显示所获8只转基因FVB小鼠均为转基因双阳性小鼠,且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的重链基因H和轻链基因L在它们的后代中稳定遗传,它们的后代中转基因小鼠双阳性率约为30%; RT-PCR和荧光定量PCR的结果显示,转基因双阳性小鼠及其双阳性后代的乳腺组织中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的mRNA表达; Western blot和ELISA等实验结果显示,转基因双阳性小鼠乳汁中存在抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26的蛋白质表达,而且抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26与羊抗人κ链抗体和羊抗人Ig G Fc-HRP抗体均能特异性结合。结论:成功构建抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因动物乳腺特异性表达载体pBC1-H和pBC1-L和制备了抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因小鼠乳腺生物反应器模型,为今后抗p185~(erbB2)人鼠嵌合抗体ChAb26转基因牛乳腺生物反应器的研究奠定了理论和技术基础。     

丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi可参与调节线粒体中的适配蛋白p66Shc

目的:p66Shc在线粒体内积累和HtrA2/Omi的功能缺陷都能导致线粒体损伤,诱导细胞凋亡.探讨在线粒体中HtrA2对p66Shc的调控作用.方法:构建p66Shc和成熟型HtrA2的真核表达质粒,共转染HEK293T细胞,免疫印迹法(Western blot)检测p66Shc蛋白;构建原核表达质粒,大肠杆菌纯化蛋白,体外切割实验,SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色检测;提取HtrA2功能缺陷小鼠( mnd2)大脑组织的线粒体,检测线粒体内p66Shc的蛋白水平.结果:细胞实验和体外实验证明HtrA2可以切割p66Shc,且在mnd2小鼠大脑中,线粒体内p66Shc的蛋白水平明显升高(P＜0.05).结论:p66Shc是HtrA2的直接底物,且HtrA2参与调节线粒体中p66Shc的蛋白水平,揭示了HtrA2发挥神经保护功能新的可能机制.     

pCAGGs-miR-483重组质粒构建及miR-483转基因小鼠模型的建立

miR-483是近年发现的一种编码于胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor2,Igf2)基因第2内含子的microRNA.研究表明,高脂饮食诱导的肥胖动物的心脏、肝脏及肝、肾肿瘤组织中miR-483表达异常,但其生物学功能尚待研究.建立稳定表达miR-483并能够传代的miR-483转基因小鼠是研究其功能的重要环节.利用特异miR-483克隆引物,以小鼠基因组为模版,经PCR获得pre-miR-483片段,通过重组构建pCAGG-miR-483重组质粒.该质粒可在真核细胞中稳定表达成熟miR-483.再利用原核显微注射法建立miR-483过表达转基因小鼠.利用实时PCR检测各组织miR-483含量.结果显示,miR-483转基因小鼠心肌、骨骼肌、肝脏等组织可过表达成熟miR-483.此外,miR-483转基因过表达小鼠较野生型小鼠体重降低,提示miR-483可能在发育、代谢等方面具有调节作用.miR-483转基因小鼠模型的建立为microRNA功能研究提供了在体研究的平台.     

造血干细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

EDAG是在胚胎发育阶段造血干细胞特异性表达的基因.为了在早期造血组织细胞中实现相关基因的条件敲除,构建了含有早期造血组织特异性表达的EDAG启动子和Cre重组酶基因的转基因EDAG-Cre表达载体质粒.通过显微注射的方法将线性化的5.6kb的EDAG-Cre转基因片段导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生小鼠经过PCR鉴定,常规方法培育传代.结果发现,共获得了6只阳性转基因首建鼠,其中4只已经建系并稳定传代.RT-PCR分析表明Cre重组酶基因在阳性转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、外周血以及胎肝等组织中均有表达,重组酶活性也在脾和骨髓中获得确认.EDAG-Cre重组酶转基因小鼠的建立,为研究早期造血组织以及造血干细胞特异性基因条件敲除小鼠模型的建立奠定了基础.     

心脏特异性高表达hAPE1基因小鼠的构建与鉴定

本研究拟建立心脏特异性表达hAPE1转基因小鼠,为研究hAPE1基因功能及其突变与心脏发育和心血管疾病的关系提供工具动物。将人APE1(human APE1,hAPE1)基因插入到心脏特异性启动子α-肌球蛋白重链(α-MHC)下游,构建了心肌细胞特异性表达hAPE1的转基因表达载体,显微注射法导入C57BL/6J小鼠受精卵中,经胚胎移植获得转基因首建者小鼠,建立hAPE1转基因小鼠,PCR鉴定转基因小鼠基因型,Western blotting鉴定h APE1蛋白在心脏中的表达并筛选高表达的转基因品系。研究表明,将含有心肌细胞特异性α-MHC启动子和hAPE1基因的转基因载体进行显微注射于小鼠胚胎中,接着将胚胎移植入假孕母鼠的输卵管中发育,建立了心脏组织特异性高表达hAPE1转基因小鼠品系,获得子代小鼠40只。PCR检测发现有15只小鼠在其基因组上整合有hAPE1基因,Western blotting检测hAPE1在这些小鼠心脏中高度特异性表达。本研究成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达hAPE1的转基因小鼠,为研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

Pin1在皮肤组织中的表达以及可诱导转基因小鼠模型的建立

目的观察Pin1在皮肤中的表达情况,构建Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型。方法将小鼠Pin1基因克隆到改造过的可与Myc标签蛋白融合的p TRE2载体中,并将线性化的DNA通过显微注射的方式构建TRE-Pin1小鼠。结果成功获得TRE-Pin1转基因首建鼠,该小鼠与上皮特异的K14-rt TA转基因小鼠配繁,获得Pin1在皮肤上皮特异性可诱导表达的双转基因鼠;通过将多西霉素(又名强力霉素,Doxycycline)加入饮水的方式诱导Pin1基因的表达,并通过Western blot,免疫组织化学等方式证明了Pin1蛋白在皮肤上皮中能特异性地过表达。我们还发现内源的Pin1在皮肤中主要表达于上皮细胞。结论成功构建了Pin1在皮肤中可诱导表达的转基因小鼠模型,为后续研究Pin1在皮肤中的功能奠定基础。     

精子特异性 Sleeping Beauty 转座酶转基因小鼠模型的建立

目的：建立精子特异性表达Sleeping Beauty （ SB）转座酶转基因小鼠模型,为研究SB转座子在小鼠中的应用提供工具。方法克隆精子特异性启动子用以驱动SB转座酶基因的表达,建立精子特异性表达SB转座酶的载体,利用显微注射方法建立以C57BL/6J为背景的精子特异性表达SB转座酶的转基因小鼠。 PCR鉴定首建鼠的基因型,western blot（WB）和免疫组织化学（IHC）检测SB转座酶基因在小鼠生殖腺睾丸中的表达情况,筛选睾丸中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结果显微注射方式获得了5只首建小鼠,其中3只能稳定传代,利用WB和IHC成功的筛选出一株在精子中高表达SB转座酶的转基因小鼠。结论成功建立了精子特异性高表达SB转座酶转基因小鼠模型,为将SB转座子作为一种基因工程工具应用于小鼠基因修饰模型的建立提供非常重要的工具资源。     

生长激素促进斑马鱼尾鳍的再生

目的建立生长激素过表达的转基因斑马鱼,研究生长激素在斑马鱼尾鳍再生过程中的作用。方法利用Gateway技术构建表达质粒"pDestTol2CG2; ubi:GH-polyA",在一细胞期显微注射表达质粒和转座酶mRNA后,通过荧光显微镜和qPCR技术筛选鉴定GH过表达的转基因斑马鱼。将斑马鱼分为对照组(野生型)和生长激素过表达组,尾鳍横切后,记录分析斑马鱼尾鳍再生过程。结果转基因斑马鱼中心脏被绿色荧光蛋白标记。荧光定量PCR检测结果显示GH表达水平显著高于对照组(P<0.05)。斑马鱼尾鳍横断后,生长激素过表达组的再生速度显著提高(P<0.05)。结论建立稳定生长激素过表达的转基因斑马鱼品系,过表达生长激素能够提高斑马鱼尾鳍再生速度。     

慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠

目的利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白（mRFP）转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台。方法将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠。结果移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只（R3和R4）鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP（R1、R2和R5）或荧光强度（R6）与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只（R1、R2、R3、R4和R5）基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果。此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达。结论建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉（RNAi）,并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础。     

Transgenic mice with neuron-specific overexpression of HtrA2/Omi suggest a neuroprotective role for HtrA2/Omi

Mammalian serine protease HtrA2/Omi has been known as an apoptosis inducer involved inactivation of caspase-dependent as well as caspase-independent cell death. Recent studies with the HtrA2/Omi mutant and knockout mouse models, however, suggested that HtrA2/Omi might play a protective role in neurons. It is important to establish a transgenic mouse model with neuron-specific overexpression of HtrA2/Omi to clarify the physiological function of mammalian HtrA2/Omi in neurons. In the present study, a transgene containing HtrA2/Omi cDNA downstream of a rat neuron-specific enolase promoter was constructed and microinjected into the pronuclei of fertilized zygotes to establish transgenic mice. Transgenic mice successfully overexpressed HtrA2/Omi in brain tissue. As expected, HtrA2/Omi-overexpressing transgenic mice showed normal development without any sign of apoptotic cell death. Our results suggest that the primary function of neuronal HtrA2/Omi might be to protect neurons against stress in contrast to its role in the somatic system.     

低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白在心脏特异转基因小鼠中引起的心脏功能代偿

目的建立心脏特异表达的低密度脂蛋白受体相关蛋白2结合蛋白(Lrp2bp)转基因小鼠,研究该基因在心肌病发病中的作用。方法克隆鼠源Lrp2bp基因入α-MHC启动子下游,构建a-MHC-Lrp2bp表达载体,显微注射法建立Lrp2bp转基因小鼠。PCR鉴定转基因首建鼠的基因型。Westernblotting鉴定Lrp2bp在心脏中的表达,心脏超声检测转基因鼠及野生型小鼠心脏结构和功能,透射电镜观察心肌细胞的超微结构改变。结果得到了4个Lrp2bp转基因品系,其中3个品系心脏Lrp2bp蛋白表达量与同龄野生型鼠相比明显增加。1M龄转基因小鼠与同窝阴性对照小鼠相比,心壁变厚,心腔变大,射血分数和短轴缩短率下降。结论心脏特异表达的Lrp2bp基因能引起心肌肥厚表型,可能是参与心肌代偿性肥厚的基因之一。     

人G-CSF转基因鼠的稳定遗传与表达

利用人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）基因组基因作为目的片段,将其受控于２．６ｋｂ的小鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的调控区下,通过显微注射法获得了两只整合有人Ｇ－ＣＳＦ转基因小鼠,通过繁殖建立了稳定的转基因系．一些表型参数测定表明转基因鼠与正常鼠无明显差别．通过ＲＴ－ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ检测,在乳腺表达出人Ｇ－ＣＳＦ,为乳腺表达外源蛋白质及今后大动物研究奠定了基础．     

心肌α肌球蛋白重链启动子驱动的CREG蛋白表达载体的构建及鉴定

目的：构建心肌特异性α-肌球蛋白重链（α—myosin heavy chain,α—MHC）启动子启动E1A基因阻遏子（cellular repressor of E1A—stimulated genes,CREG）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）融合的真核表达载体。绿色荧光蛋白作为报告基因,方便在心肌细胞中直接观察CREG蛋白的表达,为心肌特异性转CREG基因动物模型制备提供载体。方法：用BamHI和EcoRI双酶切pcDNA3．1myc—His／hCREG质粒得到CREG基因,亚克隆入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-N1中,构建pCREG-EGFP-N1;根据Genebank中公布的α-MHC基因的启动子序列,人工合成pUC57-α-MHC启动子基因序列,经AseI和NheI双酶切得到启动子α—MHC,亚克隆入pCREG—EGFP-N1中替代原CMV启动子,构建pα-MHC-CREG—EGFP-N1,测序鉴定。用脂质体法将该质粒转染体外培养的小鼠原代心肌细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达;Western blot检测CREG蛋白的表达。结果：成功构建pα—MHC—CREG-EGFP-N1质粒,酶切及测序结果正确;成功转染入原代培养小鼠心肌细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Westem blot检测到CREG蛋白的表达。结论：重组质粒pα-MHC—CREG—EGFP-N1体外转染入原代培养小鼠心肌细胞后,目的基因能够在心肌细胞中有效表达,检测方法简便可靠,为下一步建立心肌细胞特异性表达CREG的过表达转基因小鼠、深入探讨CREG在心肌疾病发生中的生物学功能研究奠定了基础。     

TNNI2突变转基因小鼠模型的建立

目的建立TNNI2突变转基因小鼠模型。方法构建pEGFP-tnni2转基因构件,TNNI2基因的第175个氨基酸缺失,通过原核显微注射法。把线性化、纯化后的外源基因pEGFP-tnni2注射入BDF1小鼠受精卵中。胚胎移植给同期发情的假孕受体母鼠,获得子代小鼠。用PCR和Southern方法检测子代鼠尾DNA鉴定基因型。通过RT-PCR方法检测tnni2基因表达。结果移植注射胚胎115枚给4只假孕小鼠共出生了23只后代鼠。经PCR和Southern方法检测得到4只阳性小鼠。对其子代进行RT-PCR检测,tnni2基因在肌肉、心脏内表达。结论通过显微注射法使外源基因pEGFP-tnni2（TNNI2基因的第175个氨基酸缺失）在小鼠基因组中得到整合,建立了转pEGFP-tnni2的转基因小鼠模型。     

高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响

目的:探究高表达人源SP15对小鼠生长和生殖的影响,为研究NYD-SP15在生物体中的功能提供动物模型。方法:将人源NYD-SP15 cDNA以及Cre序列插入PCAG启动子下游,构建NYD-SP15转基因表达载体,并通过原核注射,构建全身性表达NYD-SP15的转基因小鼠;将获得的NYD-SP15转基因小鼠与C57/BL6小鼠交配,PCR鉴定转基因小鼠是否有Cre插入,筛选出人源NYD-SP15表达的小鼠,统计转基因小鼠体重变化和后代阳性情况。结果:通过PCR鉴定及公司测序验证,我们成功构建了NYD-SP15转基因过表达载体。并通过PCR鉴定小鼠基因型,筛选出可以表达人NYD-SP15的转基因小鼠。比较转基因小鼠与同窝野生型小鼠体重,发现转基因小鼠体重与同窝野生型小鼠相比无明显区别,说明在体内过表达NYD-SP15对小鼠体重无明显影响。通过对后代阳性小鼠出生情况统计发现F2代阳性小鼠出生率较F1代明显降低。结论:人源NYD-SP15在小鼠体内能正常表达,对其生长无明显影响,但其后代阳性出生率呈逐代下降趋势,推测该原因可能与NYD-SP15在睾丸中表达有关。     

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(ＭＳＣ)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗ＤＭＤ疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5.58×10¹²vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdx MSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdx MSCs进行同种异体移植治疗ＤＭＤ疾病奠定了基础。