携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(ESbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此ESbla的活性.携带此ESbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的ESbla.     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(Esbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此Esbla的活性.携带此Esbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的Esbla.     

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β—内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(ESbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此ESbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β-内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(Esbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此Esbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

吉戈菲肠杆菌中SHV-2耐药基因的序列分析

近来一个值得注意的现象,即肠杆菌科中某些菌属对头孢噻甲羧肟(ceftazidime,caz)等三代头孢菌素的耐药有不同程度增长,这是由于细菌产生了超广谱β-内酰胺酶(ESbla),或染色体Ⅰ型酶所致.在我们前一步的研究中,发现一耐caz的Ent.gergoviae菌株,含有一约60kb的可接合转移质粒pC3773.其上有一编码SHV类ESbla的基因,为深入了解此ESbla基因的分子特点,以及酶结构与功能的关系,本文用测定核苷酸序列的方法进行了研究.     

超广谱β-内酰胺类抗生素的耐药性与耐药质粒介导

目的：观察超广谱β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药质粒的关系,探讨耐药质粒在细菌之间传递的方式。方法：(1)配制耐药质粒提取试剂;(2)对LB细菌培养液进行耐药质粒的提取与检测;(3)对从12株ESBL细菌中提取的质粒进行质粒转化、质粒接合传递及药敏试验。结果：(1)此12株ESBL细菌中提取的耐药质粒进行电泳显示此质粒较大,约20．0kb。(2)质粒转化后,其转化子对β-内酰胺类抗生素全部耐药,对氨基糖甙类、喹诺酮类和磺胺类全部敏感。质粒结合传递体的耐药谱与以上相同。结论：β-内酰胺类抗生素的敏感性与耐药质粒介导密切相关,耐药质粒能把耐药基因传递给其他细菌,在细菌之间相互传递。     

从耐药产气肠杆菌中首次发现DNA旋转酶A亚单位基因gyrA新的变异型

目的 全面了解2株耐药产气肠杆菌对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类的耐药机制.方法 2株耐药产气肠杆菌:zjm001株和zjm002株,分离自2012年3月一家三级甲等医院住院患者送检的血液标本,做gyrA和parC基因扩增、测序、GenBank比对确认菌种,再用PCR法分析39种β-内酰胺类药物获得性耐药基因、14种氨基糖苷类药物获得性耐药基因、7种喹诺酮类耐药相关基因、11种可移动遗传元件标记.结果 zjm001株的β-内酰胺类耐药基因检出CTX-M-3,氨基糖苷类耐药基因检出ant(3”)-Ⅰ,喹诺酮类耐药基因检出gyrA突变,可移动遗传元件检出int Ⅰ 1、ISEcp1、IS26、IS903;zjm002株的β-内酰胺类耐药基因检出ACT-1、CMY-2,喹诺酮类耐药基因检出gyrA突变.2株耐药产气肠杆菌的gyrA基因序列均为新变异型,GenBank登录号分别为:JX268598,JX273641.结论 2株耐药产气肠杆菌的耐药基因与耐药表型相符.在耐药产气肠杆菌中发现DNA旋转酶A亚单位基因gyrA新变异型是国内首次报道.     

肉食鸡中产超广谱β-内酰胺酶的耐药性大肠杆菌的检测和分析

【目的】本文对山东某屠宰场的肉食鸡内脏中的大肠杆菌进行了β-内酰胺类抗生素的耐药性监测和分析。【方法】从屠宰场的肉食鸡中获取内脏样品,处理并筛选得到对β-内酰胺类耐药的大肠杆菌。通过抑菌圈法对细菌耐药性进行分析。提取细菌DNA,进行系统发育亚型分析。检测并鉴定菌株中β-内酰胺酶基因和整合子的结构,并进行了接合转移实验。【结果】检测到对3种及以上的β-内酰胺类药物同时具有耐药性的大肠杆菌占总菌的80%以上。编码A类β-内酰胺酶的bla_(TEM)和bla_(CTX-M)耐药基因存在率较高,分别为86.7%和81%,但仅bla_(CTX-M)与β-内酰胺类药物的耐药性呈现显著相关性。B_1和D_2亚型的大肠杆菌中β-内酰胺耐药基因的检出率较高,并且显著增强了大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药性,而A_0和A_1亚型菌株对β-内酰胺类药物较敏感。尽管整合子在大肠杆菌中普遍存在,但它们伴随β-内酰胺酶基因转移到受体菌的比例很低,说明二者之间的相关性较低。【结论】本文结果显示肉鸡源大肠杆菌对β-内酰胺类药物的耐药程度较高,多重耐药情况普遍存在。本文明确了大肠杆菌中β-内酰胺类抗生素的耐药性与系统发育之间的联系,为肉鸡源大肠杆菌中β-内酰胺耐药性的流行监测提供参考依据。     

质粒介导碳青霉类抗生素耐药性产生的研究进展

碳青霉烯类抗生素是治疗β-内酰胺酶类耐药革兰氏阴性杆菌感染的最有效手段,也是目前对抗耐药细菌最有效的抗菌药物之一。但随着碳青霉烯类耐药菌的出现,无疑给临床抗菌药物选择带来严峻的考验。临床上发现的碳青霉烯类耐药菌常含碳青霉烯酶,可分为A、B、D三类：A类为肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemases,KPCs),B类为是新德里金属酶(new Delhi metalloenzyme,NDM)、亚胺培南酶(imipenemase,IMP)和维罗纳整合子金属β-内酰胺酶(verona integronencoded metallo-β-Lactamases,VIM),D类为是苯唑西林酶(Oxacillinase,OXA)。目前发现编码这些酶的基因大都位于质粒上,使得这些耐药基因能够在细菌之间进行水平或垂直传播。该文将介绍近年编码不同碳青霉烯酶的基因通过质粒的介导在革兰氏阴性杆菌中的分布、表达与传播,以期为科学防控碳青霉烯类耐药菌及合理使用抗菌药物提供理论依据。     

福建某基层医院CRE碳青霉烯类耐药基因分析

目的对福建省南平市第二医院分离的碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌进行碳青霉烯类基因和其他β内酰胺类耐药基因检测。方法收集碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌,采用Vitek-2 Compact全自动细菌鉴定/药敏仪器进行细菌鉴定和药敏试验;采用改良Hodge试验对实验菌株进行表型检测;利用PCR及测序法对常见的碳青霉烯类和β-内酰胺类耐药基因进行检测;质粒接合试验检测碳青霉烯类耐药基因是否具有可转移性。结果共收集到4株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌,呈多重耐药性。2株改良Hodge试验阳性。试验菌株均检出碳青霉烯类耐药基因(NDM-1、IMP-8或VIM-2),并同时携带有其他β内酰胺类基因;4株细菌中有3株的碳青霉烯类耐药基因接合成功。结论碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌已在福建基层医院出现,并具有一定传播性,应引起相关主管部门的注意,以防耐药菌的流行。     

吉戈菲肠杆菌中SHV-2耐药基因的序列分析

近来一个值得注意的现象,即肠杆菌科中某些菌属对头孢噻甲羧肟(ceftazidime,caz)等三代头孢菌素的耐药有不同程度增长,这是由于细菌产生了超广谱β-内酰胺酶(Esbla),或染色体Ⅰ型酶所致.在我们前一步的研究中,发现一耐caz的Ent.gergoviae菌株,含有一约60kb的可接合转移质粒pC3773.其上有一编码SHV类Esbla的基因,为深入了解此Esbla基因的分子特点,以及酶结构与功能的关系,本文用测定核苷酸序列的方法进行了研究.     

金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因及抗生素耐药相关基因检测

目的 了解温州地区临床分离的金黄色葡萄球菌(SA)的耐药特点,探讨SA中耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类药物耐药基因及耐消毒剂基因(qacA)的存在情况.方法 采用聚合酶链式反应(PCR)法对SA进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、四环素类基因和耐消毒剂基因检测.结果 PCR结果显示94株SA中耐药相关基因检出率mecA 53.2％、aac(6’)/aph(2")68.1％、aph(3’)-Ⅲ 37.2％、tetM 53.2％和qacA 7.4％,其中59株MRSA的耐药相关基因检出率分别为mecA 83.1％、aac(6’)/aph(2")86.4％、aph(3 ′)-Ⅲ 42.4％、tetM 76.4％和qacA 8.5％.结论 多数SA菌株存在耐β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类等多种抗生素耐药基因,具有多重耐药特征,但尚未出现明显耐消毒剂状况.     

1株多重耐药肺炎克雷伯菌耐药基因和整合子、转座子遗传标记研究

目的 了解多重耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因存在状况和遗传学背景。方法 聚合酶链反应(RCR)法对多重耐药的肺炎克雷伯菌进行β-内酰胺酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、质粒AmpC酶基因、qacEΔ1-sull耐消毒剂和磺胺基因、整合子遗传标记(整合酶基因)、Tn21/Tn501转座子遗传标记(汞离子还原酶基因)检测。结果 TEM、SHV型β-内酰胺酶基因, DHA型质粒AmpC酶基因,aac(6′)-1型氮基糖苷类修饰酶基因,qacEΔ1-sul1耐消毒剂和磺胺基因,整合子遗传标记(intI1整合酶基因),Tn21/Tn501转座子遗传标记(merA汞离子还原酶基因)检测阳性。结论 多重耐药肺炎克雷伯菌存在多种耐药基因和Ⅰ类整合子、Tn21/Tn501转座子。     

宋内志贺氏菌1173质粒基因组及耐药基因转移机制

【目的】研究质粒介导宋内志贺氏菌1173耐药基因bla_(CTX-M-64)转移的机制。【方法】用双纸片协同扩散法验证1173是否产超广谱β-内酰胺酶(ESBL),用PCR扩增鉴定其携带的耐药基因,接合转移实验检验其耐药质粒是否可通过接合转移给其他细菌,并对接合子是否产ESBL和携带耐药基因进行检验,利用VITEK~?2检测1173和接合子的耐药谱,提取质粒进行高通量基因组测序,并对质粒序列进行生物信息学分析,以研究其耐药基因转移机制。【结果】1173是产ESBL的多药耐药宋内志贺氏菌,携带的耐药基因有bla _(CTX-M-64)和bla _(TEM),其中的bla _(CTX-M-64)可通过接合转移作用传递给受体菌EC600,并使接合子具有相应的耐药谱。经序列测定和生物信息学分析表明,介导bla _(CTX-M-64)水平转移的是ISEcp1-bla_(CTX-M-64)-Δorf477转座单元。【结论】质粒携带的bla_(CTX-M-64)介导1173对多类抗菌药物的耐药,ISEcp1-bla_(CTX-M-64)-Δorf477转座单元介导bla_(CTX-M-64)在细菌间的转移。     

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。     

AmpC酶及其分子生物学检测

随着抗生素的大量使用,细菌耐药问题日益突出,其中β-内酰胺类药是临床应用最多的抗生素。而药物被β-内酰胺酶水解灭活是细菌耐药的主要原因。近年来革兰阴性杆菌中,AmpC酶(属Bush-J-M1群)已逐渐成为临床面临的严重治疗问题。本文简要介绍AmpC酶的一般特性,产酶基因的结构、功能和表达调控。另外,与几种传统的检测该酶的方法相比,分子生物学方法准确性高,且特异性好,文中重点介绍了PCR,核酸分子杂交,核酸序列分析等方法。     

几丁质酶-葡聚糖酶双价基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆(Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草(Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5 kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系"南29"中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探针对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同.     

肺炎克雷伯菌质粒p1512-KPC的测序及比较基因组学分析

【目的】对多重耐药的肺炎克雷伯菌1512中的质粒p1512-KPC进行测序及比较基因组学的分析。【方法】利用16S rRNA基因测序进行菌种鉴定,根据7对管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)对菌株进行多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)。利用PCR进行耐药基因的筛查,通过接合转移实验及电转化实验将质粒转入受体菌大肠杆菌EC600。采用改良Carba NP法检测细菌碳青霉烯酶的活性以及类型,使用VITEK2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析仪检测菌株最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration,MIC)。最后通过高通量测序技术结合生物信息分析手段明确菌株1512及质粒p1512-KPC的耐药基因谱,并通过比较基因组方法对质粒p1512-KPC的基本结构、耐药基因遗传环境及移动元件等结构基因组学特征进行分析。【结果】菌株1512为产A类碳青霉烯酶的多重耐药肺炎克雷伯菌,MLST分型结果显示该菌为ST11型。经PCR筛查,菌株1512包含bla_(KPC-2)、dfrA1和sul1耐药基因,其中bla_(KPC-2)基因位于不可结合转移但电转成功的质粒p1512-KPC上。测序结果显示,质粒p1512-KPC长度为117.69 kb,同时包含IncFII型复制子和属于Rep_3家族但类型未知的复制子repB,并携带耐药基因bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)、bla_(TEM-1)及rmtB。其中bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)及bla_(TEM-1)分别存在于截短的Tn6296、Tn6367及截短的Tn2的基因环境中。【结论】携带bla_(KPC-2)、bla_(CTX-M-65)、bla_(TEM-1)及rmtB基因的质粒p1512-KPC介导了肺炎克雷伯菌1512对青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类及氨基糖苷类抗生素耐药,并能引起相应耐药基因的水平传播。此外,本研究还对IncFII型复制子和Rep_3家族复制子repB共存的质粒进行了比较基因组分析,为该类型质粒的多样性和进化提供了更深入的理解。     

耐多药鲍曼不动杆菌耐药基因检测结果的样本聚类分析

目的 调查一组耐药鲍曼不动杆菌菌株间的亲缘关系.方法 收集2010年1月至2010年12月浙江某医院ICU患者痰液标本中分离的耐药鲍曼不动杆菌共20株,采用聚合酶链反应(PCR)的方法分析3种与耐药相关的看家基因(carO、gyrA、parC)和55种水平转移获得与β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类耐药相关基因以及12种接合性质粒、转座子、插入序列、整合子等可移动遗传元件遗传标记,再对检测结果作样本聚类分析.结果 20株耐药鲍曼不动杆菌共检出3种与耐药相关的看家基因carO、gyrA、parC,4种获得性β-内酰胺类耐药基因(TEM-1、ADC-30、ADC-60、OXA-23),5种获得性氨基糖苷类耐药基因[aac(3)-Ⅰ、aac(6')-Ⅰ b、ant(3”)-Ⅰ、aph(3’)-Ⅰ、armA],2种抗菌制剂外排泵基因(adeB、qacE△1),5种可移动遗传元件的遗传标记(int Ⅰ 1、tnpU、tnp513、IS26、ISaba1).样本聚类分析提示,20株耐药鲍曼不动杆菌可分为A与B二个簇,A簇群均为多耐药(MDR)株;A簇群又可分为A1(ADC-60阳性)与A2簇群(ADC-30阳性),均为克隆传播.B簇群均为泛耐药(PDR)株,除8号株外为克隆传播.结论 MDR和PDR菌株中均存在克隆传播.获得菌株之间的亲缘关系对院内感染实时监测和控制院内感染意义重大.     

儿童呼吸道流感嗜血杆菌分离株耐药性与β-内酰胺酶基因研究

目的 调查儿童呼吸道流感嗜血杆菌分离株的耐药性和产β-内酰胺酶情况,研究分离株β-内酰胺酶基因的特征.方法 2011年1月到2012年6月,从儿童呼吸道分离流感嗜血杆菌,用微量肉汤稀释法测定常用抗生素最低抑菌浓度;用Nitrocefin纸片法检测β-内酰胺酶;用PCR扩增结合限制性内切酶酶切分析对分离株β-内酰胺酶基因进行分型;比较TEM+菌株和ROB-1+菌株、TEM-1+菌株和TEM-2+菌株对常用抗生素的耐药性.结果 537株流感嗜血杆菌的β-内酰胺酶产酶率为52.3％(281/537);产酶株对氨苄西林、头孢克洛、头孢呋辛的MIC50、MIC90和耐药率明显高于非产酶株(P＜0.05);产酶株TEM基因阳性率为91.8％(258/281),其中90.3％为TEM-1型(233/258),7.4％为TEM-2型(19/258),ROB-1基因阳性率为8.2％(23/281);ROB-1+菌株对氨苄西林和阿莫西林/克拉维酸的MIC50和MIC90高于TEM+菌株,但头孢菌素类的MIC50和MIC90低于TEM+菌株;除头孢呋辛外,TEM-1+菌株和TEM-2+菌株对β-内酰胺类的MIC50和MIC90差异无统计学意义.结论 成都地区儿童呼吸道流感嗜血杆菌分离株β-内酰胺酶产酶率较高,产酶株主要携带TEM-1基因,对氨苄西林、头孢克洛和头孢呋辛等β-内酰胺类的影响明显.