几丁质酶—葡聚糖酶双介基因导入滇型杂交稻恢复系提高稻瘟病抗性的研究

将含有菜豆（Phaseolus limensis)几丁质酶基因和烟草（Nicotiana tabacum)β-1,3-葡聚糖酶基因的pBLGC(16.5kb)质粒用基因枪法导入滇型杂交稻（Oryza sativa L.ssp.japonica)恢复系“南29”中,总计获得93个转化再生植株,以β-1,3-葡聚糖酶基因制备探讨对T1代株系进行Southern杂交分析,17个株系为杂交阳性,证实外源基因完整结构已整合到水稻基因组中;连续多代的PCR追踪检测证实外源基因已遗传至T4代;对所获得的6个PCR检测阳性T4代品系进行了稻瘟病菌（Magnaporthe grisea)生理小种接种鉴定和稻瘟病大田诱发鉴定,结果表明,转基因品系对稻瘟病的抗性较受体对照大幅度提高,获得了稻瘟病新抗源,但不同品系稻瘟病抗性并不相同。     

转化双价防卫基因获得抗纹枯病水稻

将水稻几丁质酶基因(RCHIO)和苜蓿β-1,3-葡聚糖酶基因(AGLU)串联构建于一个表达质粒pZ100,经农杆茵介导法转化粳稻台北309,获得15个阳性独立转化子。T1代植株经Southern检测,表明外源基因已整合到了水稻基因组;经Northern检测,表明外源基因在RNA水平表达,在株系间有差异,2个酶基因的表达水平类似。T1代植株经纹枯病病茵接种鉴定,表明各株系对纹枯病具有不同的抗性,且抗病能力与2个外源基因的RNA表达水平有剂量关系,并获得了2个酶基因高表达且对纹枯病具有较高抗性的T1株系,可作为进一步进行分子育种的材料。     

发根农杆菌介导几丁质酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因转化烟草的研究

用冻融法和三亲交配法将具有几丁质酶基因、β—1,3—葡聚糖酶基因和卡那霉素抗性标记基因的质牲pBLGC导入具有Ri质粒的发根农杆菌中。用叶盘法转化烟草的三个品种,经Kan抗性筛选获得126株再生植株,对119株再生植株分别以启动子CaMV35S、几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因的引物进行PCR检测,其中几丁质酶基因至阳性的植株有72株,β—1,3—葡聚糖酶基因至阳性的有47株,具有几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因的植株有36株。对转化的24株转基因经PCR-Southern杂交,结果均至阳性。实验结果表明,外源基因的转化频率与植物品种、外源基因片段的大小有关,几丁质酶基因和β—1,3—葡聚糖酶基因分别或共同整合到植物基因组中。     

转双价水解酶基因番茄植株对枯萎病抗性的提高

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,首次将莱豆几丁质酶和烟草β-1,3-葡聚糖酶双价水解酶基因导入番茄品种A53(Lycopersicon esculentum cv.A53)中,获得批量转基因再生植株。对外源基因的PCR和Southern杂交结果表明,外源基因已经整合到番茄基因组中,其拷贝数1-8个不等。Northern杂交和卡那霉素喷施表明目的基因和标记基因均已得到表达,抗病性鉴定初步表明转基因植株对枯萎病的抗性显著提高。     

导入双价基因的转基因杂交油菜亲本及其对菌核病抗性的研究

比较了乙酰丁香酮、pH、共培养温度及不同激素配比对根癌农杆菌转化油菜(Brassica napus)的影响,建立了油菜高效转化体系.按该体系,将组成型表达几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因转化甘蓝型双低杂交油菜亲本恢复系和保持系,获得了转基因恢复系和保持系植株.对再生植株进行PCR和SouthemBlot检测,结果表明外源基因已整合到油菜基因组中.连续3代的PCR检测及转基因植株抗病性在自交后代中得到保持,证实外源基因已遗传到T3代.对转基因植株T1代离体叶进行菌核病菌丝体接种和T1及T2代大田自然侵染鉴定,结果表明,转基因恢复系棚40-12、棚40-32和保持系96B-2对菌核病的抗性比受体对照大幅度提高,大田鉴定其发病率连续2年均比受体对照减少78%以上,比抗病品种‘中油821'减少75%以上,病情指数比受体对照和‘中油821'减少均达显著水平,其抗病性能在后代稳定遗传,获得了高抗菌核病的转基因育种材料.     

β-1,3-葡聚糖酶在植物抗真菌病基因工程中的研究进展

β-1,3-葡聚糖酶是植物抗真菌病的重要抗性物质之一,植物β-1,3-葡聚糖酶可由病原物(如Mg)、化学因子(如水杨酸、乙烯、赤霉素)或物理因子(如紫外线照射、机械损伤)等多种生物因子和非生物因子诱导产生.将外源β-1,3-葡聚糖酶基因导入植物,可提高植物的抗真菌病害的能力;而将β-1,3-葡聚糖酶基因与其他防卫蛋白基因同时导入植物,将更大程度的提高植物的抗真菌病能力,是植物抗真菌病防治的有效新途径.文章中主要对β-1,3-葡聚糖酶的生物学特性、植物β-1,3-葡聚糖酶基因在转基因植株中的独立表达及其与其他抗真菌病基因的协同表达等进行了综述.     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及其对黄萎病的抗性

通过根癌杆菌介导法,将维管束特异启动子(竹节花黄斑病毒启动子CoYMV)启动的几丁质酶和CaMV35S启动的β-1,3-葡聚糖酶嵌合双价基因,导入陆地棉品种冀合321和中棉所35。利用卡那霉素涂抹法对转基因株的卡那霉素抗性进行初步鉴定,再经PCR和Southern杂交确证,结果显示双价抗病基因分别以1～2个拷贝整合到棉花基因组内。对转基因株系T3幼苗进行无底塑钵菌液浇根法鉴定和大田病圃鉴定,结果显示：7个转化株系均表现不同程度的抗或耐黄萎病性,苗期鉴定结果和大田病圃调查结果基本一致;其中D9910、D9915和D9919等3个转基因纯合系的大田病情指数分别为6．5、9．4和9．5．均达到高抗水平。对以上3个高抗黄萎病的纯合系进行遗传分析,结果显示这3个抗病纯合系的卡那霉素抗性符合一对显性基因分离规律。结合分子杂交验证结果,可以认为这3个转基因株均含有一个拷贝的双抗病基因。     

枯草芽孢杆菌SC2-4-1葡聚糖酶基因gluB的克隆及序列分析

β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性检测结果表明,从辣椒根际筛选的拮抗菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SC2-4-1能产生β-1,3-1,4-葡聚糖酶.以菌株SC2-4-1的基因组DNA为模板,用PCR方法克隆了该菌的葡聚糖酶基因gluB,其开放阅读框为711bp,编码237个氨基酸.Blast分析,该序列与已报道的多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)ATCC 842的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因gluB相似性为85%.所得基因序列的系统发育分析显示,该基因属于β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因.DNAMAN软件比对,所得葡聚糖酶氨基酸序列具有催化裂解β-1,3-和β-1,4-糖苷键的葡聚糖酶活性位点.     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

水杨酸和黄萎病菌毒素处理棉花愈伤组织使β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性增加

不同品种棉花(Gossypium hirsutum L.)愈伤组织对黄萎病菌毒素粗提物的抗性与体内β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性水平有关.在毒素处理下,抗性品种比感性品种酶活性增加的幅度大、时间早.外源水杨酸(SA)处理后,棉花愈伤组织中的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性增加.抗β-1,3-葡聚糖酶多克隆抗体与28 kD的蛋白条带有免疫交叉反应,毒素、SA、毒素+SA均能诱导该蛋白条带出现.     

导入双价基因的转基因杂交油菜亲本及其对菌核病抗性的研究

比较了乙酰丁香酮、pH、共培养温度及不同激素配比对根癌农杆菌转化油菜(Brassica napus)的影响, 建立了油菜高效转化体系。按该体系, 将组成型表达几丁质酶和β-1, 3-葡聚糖酶基因转化甘蓝型双低杂交油菜亲本恢复系和保持系, 获得了转基因恢复系和保持系植株。对再生植株进行PCR和Southern Blot检测, 结果表明外源基因已整合到油菜基因组中。连续3代的PCR检测及转基因植株抗病性在自交后代中得到保持, 证实外源基因已遗传到T3代。对转基因植株T1代离体叶进行菌核病菌丝体接种和T1及T2代大田自然侵染鉴定, 结果表明, 转基因恢复系棚40-12、棚40-32和保持系96B-2对菌核病的抗性比受体对照大幅度提高, 大田鉴定其发病率连续2年均比受体对照减少78%以上, 比抗病品种‘中油821’减少75%以上, 病情指数比受体对照和‘中油821’减少均达显著水平, 其抗病性能在后代稳定遗传, 获得了高抗菌核病的转基因育种材料。     

导入β-1,3-葡聚糖酶及几丁质酶基因的转基因可育油菜及其抗菌核病的研究

利用农杆菌转化法,将组成型表达β-1,3葡聚糖酶及几丁质酶基因的双价植物表达载体pBLGC转化优质甘蓝型油菜品种H165,并得到了抗卡那霉素(Kanamycin,Kan)的再生植株。我们对所得到的抗Kan的再生苗进行了初步分子生物学检测,结果表明,在K15(Kan15mg/L)培养基上的绿苗中有30%为PCR阳性植株,而在K25(Kan10mg/L)培养基上的绿苗有53%的阳性率。对部分PCR阳性的转基因植株进行了点杂交分析,结果均表现出较强的杂交信号,这初步说明外源基因已整合到油菜基因组中。转基因植株的活体接种油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorium)试验表明,部分转基因植株比对照显示较强抗病性。     

几丁质酶基因导入西瓜植株及其抗病性鉴定研究

利用西瓜有性生殖过程 ,将携带有外源几丁质酶基因的质粒DNA涂抹在授粉后的柱头上 ,使其沿花粉管通道进入到生殖细胞 ,得到转化处理种子。转化T1代植株经除草剂Basta筛选和PCR扩增获得转化植株。对T3 代株系进行田间自然发病和人工接种鉴定获得 3个抗枯萎病的株系。结果表明 :几丁质酶对镰刀菌引起的西瓜枯萎病有一定的抑制作用 ,利用花粉管通道法直接导入西瓜活体植株的技术是可行的。     

几丁质酶、葡聚糖酶与萝卜抗真菌蛋白RS-AFP2基因三价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组

利用基因工程技术构建了含有几丁质酶(Chitinase,Chi．)、β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-Glucanase,Glu．)、萝卜抗真菌蛋白(Raphanus sativus-antifingal protein,Rs-AFP2)的三价植物表达载体,并通过农杆菌直接转化法将三价植物表达载体转入农杆菌EHA105,分别为GC R／pCAMBIA1300／EHA105和RC G／pCAMBIAl300／EHA105,并采用PCR、DNA dot blotting技术对其进行了鉴定分析,证明获得了阳性的重组农杆菌工程菌株。     

番茄红素β-环化酶基因的玉米转化及 后代遗传分析

利用农杆菌介导法将番茄红素β-环化酶基因(Lycb)转入由玉米自交系天塔五号植株,分析基因在T0转化及后代的遗传情况,结果表明,在27株T0转基因植株中,PCR初步检测后8株呈阳性;将T1代转基因植株以株系为单位用200mg/L草铵膦抗性筛选后,收获抗性植株种子。T2代转基因植株进一步进行PCR、RT-PCR和田间草铵膦涂抹检测,结果表明,PCR、RT-PCR为阳性的6个株系植株均具有草铵膦抗性。选取6株阳性植株提取叶片总类胡萝卜素,经HPLC分析其β-胡萝卜素含量显著高于野生型,表明目的基因Lycb成功的转入玉米,并得到了稳定遗传。     

转β-1,3-葡聚糖酶基因和几丁质酶基因棉花

为了提高棉花的抗枯、黄萎病的能力,用花粉管通道法,将烟草β-1,3-葡聚糖酶基因和菜豆几丁质酶基因导入棉花,获得了抗卡那霉素的转化植株。经PCR、PCR－Southern Blot检测,证明两种基因已插入到棉花基因组中。     

转小麦冷胁迫蛋白截短基因烟草及其抗病性分析

TA3-13是克隆于小麦冷胁迫蛋白基因的截短片段。原核表达的TA3-13蛋白能够诱导烟草产生显著的抗烟草花叶病毒(TMV)的作用。文章将TA3-13基因片段克隆到植物表达载体pBI121上,构建成转基因重组体pB-3-13,通过冻融法转化农杆菌EHA105,构建成转基因侵染菌株。采用叶盘法将pB-3-13转化三生烟草,经卡那霉素抗性筛选,获得48株T0代再生植株。通过PCR检测,鉴定出33株转基因单株,收获了20株种子作为T1代株系。PCR-Southern杂交结果显示,PCR阳性条带与TA3-13探针有特异性杂交,说明外源基因被转化到烟草的基因组中。选取两个T1代株系的烟草植株用于各项测定。GUS组织化学活性鉴定和RT-PCR检测结果显示,外源基因可以成功地表达。接种TMV病毒后,转基因烟草抗TMV的能力较转空载体烟草提高3～5倍。转基因烟草具有抗TMV侵入和抗病毒病害发展的作用,同时转基因烟草可以抗细菌软腐病菌的扩展。     

双价抗真菌基因表达载体的构建及转基因西瓜的研究

构建了同时含有番茄儿丁质酶基因（Chi3）和β-1,3-葡聚糖酶基因（Glu-Ac）的双价抗真菌基因植物表达载体,以西瓜（Citrullus lanatus）子叶块为外植体,采用根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法,将Chi3和Glu-Ac同时导入西瓜栽培种“中育一号”,共获得46株抗性再生植株。经PCR、Southern blot和RT—PCR检测,表明外源基因己成功整合到西瓜基因组中,并在转录水平得到表达。利用尖孢镰刀菌西瓜专化型（Fusarium oxysporum）对转基因植株进行离体叶片抗病性检测,表明转基因植株对枯萎病的抗性均有不同程度的增强。     

水杨酸和黄萎病菌毒素处理棉花愈伤组织使β-1，3-葡聚糖酶和几丁质酶的活性增加

不同品种棉花(Gossypium hirsutum L．)愈伤组织对黄萎病菌毒素粗提物的抗性与体内β-l,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性水平有关。在毒素处理下,抗性品种比感性品种酶活性增加的幅度大、时间早。外源水杨酸(SA)处理后,棉花愈伤组织中的β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性增加。抗β-1,3-葡聚糖酶多克隆抗体与28 kD的蛋白条带有免疫交叉反应,毒素、SA、毒素 SA均能诱导该蛋白条带出现。