中国南海堂皇芋螺毒素基因克隆及两个毒素的合成及活性研究

目的 研究中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)毒素基因序列,为毒素功能研究奠定基础。方法 采用Trizol法提取堂皇芋螺毒腺管的总RNA,应用3’端快速扩增cDNA末端(3’RACE)及巢式PCR技术,获得A、O、J超家族芋螺毒素新序列;或以A家族高度保守的内含子及3’端非翻译区(3’UTR)设计引物,克隆出新的α-芋螺毒素新序列。选择合成毒素ImIIA及Im1.2,测定ImIIA二硫键的连接方式,并测定两种毒素对神经型烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)的抑制活性。结果 获得11条毒素前体肽序列,分属A、O1、O2、J3等超家族,其中Im1.95为已报道芋螺毒素,其余为新发现芋螺毒素。ImIIA二硫键连接方式为少见的“C1-C2,C3-C4”,10μmol/L Im1.2、ImIIA对α2β2、α2β4、α4β2、α3β2、α3β4 5个nAChR亚型抑制活性较低。结论 通过基因克隆方法,从堂皇芋螺中获得了11个芋螺毒素,其中10个为新序列,属于A、O1、O2、J3等超家族毒素,Im1.2、ImIIA对神经型nAChR各受体亚型活性较低。     

小脑电刺激对家鸽乙酰胆碱酯酶活力的影响

选用成年健康家鸽,对小脑进行连续电刺激后,分别抽取家鸽外周血清及全脑测定乙酰胆碱酯酶活力变化,以探讨鸟类小脑刺激与乙酰胆碱酯酶活力变化之间的相关性.结果 表明:在刺激小脑皮层后,家鸽外周血清中乙酰胆碱酯酶活力显著上升(P＜0.05);而在刺激小脑皮层后,脑组织中乙酰胆碱酯酶活力显著降低(P＜0.05).推测电刺激引起外周组织乙酰胆碱释放,从而引起肌肉强直,血清中胆碱酯酶的活力升高.而电刺激小脑使抑制性神经元功能兴奋,脑中胆碱能神经元功能减弱,乙酰胆碱的释放减少,脑组织中胆碱酯酶的活力降低.     

FAM92A1-289基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

利用PCR方法扩增FAM92A1-289全长,经BamH I和Xho I酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体,构建pEGFP-N1-FAM92A1-289重组表达质粒,转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察FAM92A1-289在细胞中的定位。经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的FAM92A1-289读码框。荧光显微镜观察到空质粒pEGFP-N1转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pEGFP-N1-FAM92A1-289重组载体后,可见绿色荧光分布于Hela细胞核中,显示FAM92A1-289定位于细胞核。成功构建人FAM92A1-289真核表达载体,FAM92A1-289定位于哺乳细胞的细胞核中。     

一种来源于Leifsonia shinshuensis DICP 16菌体的β-D-木糖苷酶的分离纯化及其性质

采用盐析、DE 52、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Toyopearl Butyl 650C疏水层析以及Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析联用的方法, 从Leifsonia shinshuensis DICP 16菌体中纯化出一种β-木糖苷酶.分离后该酶在SDS-PAGE 上呈单一蛋白质条带, 通过SDS-PAGE和凝胶过滤层析法, 测得该酶是一个由两个分子量约为91 kD的相同亚基组成的同源二聚体.其水解对硝基苯酚木糖苷(pNPX)的最适反应温度为55°C, pH值为7.0.该木糖苷酶在45°C以下, pH 6.0～11.0之间具有很好的稳定性.在45°C, pH值为7.0的条件下, 水解pNPX的Km, Vmax分别为1.04 mmol/L, 0.095 mmol/(min·mg).研究不同的金属离子对该酶的活性影响, 发现Fe2+和Cu2+是很强的抑制剂.通过对天然木糖苷化合物的水解测试, 发现该酶可以水解人参皂苷Rb3的木糖基, 产生人参皂苷Rd, 却不能水解紫杉烷木糖苷的木糖基.     

一种来源于Leifsonia shinshuensis DICP 16菌体的b-D-木糖苷酶的分离纯化及其性质

采用盐析、DE 52、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、Toyopearl Butyl 650C疏水层析以及Sephacryl S-300 HR凝胶过滤层析联用的方法, 从Leifsonia shinshuensis DICP 16菌体中纯化出一种b-木糖苷酶。分离后该酶在SDS-PAGE 上呈单一蛋白质条带, 通过SDS-PAGE和凝胶过滤层析法, 测得该酶是一个由两个分子量约为91 kD的相同亚基组成的同源二聚体。其水解对硝基苯酚木糖苷(pNPX)的最适反应温度为55°C, pH值为7.0。该木糖苷酶在45°C以下, pH 6.0~11.0之间具有很好的稳定性。在45°C, pH值为7.0的条件下, 水解pNPX的Km, Vmax分别为1.04 mmol/L, 0.095 mmol/(min·mg)。研究不同的金属离子对该酶的活性影响, 发现Fe2+和Cu2+是很强的抑制剂。通过对天然木糖苷化合物的水解测试, 发现该酶可以水解人参皂苷Rb3的木糖基, 产生人参皂苷Rd, 却不能水解紫杉烷木糖苷的木糖基。     

水稻RIL群体苗期耐冷性QTL分析

水稻苗期冷害是影响早春季节和高纬度地区水稻成苗和秧苗生长的重要限制因素之一。为了鉴定控制水稻苗期耐冷性的QTL,研究采用了1个水稻“粳籼交”重组自交系(RIL)群体,结合1张高密度分子遗传图谱,对3叶期幼苗经过10℃冷处理3d、恢复培养2d和4d时的秧苗存活率进行复合区间作图。亲本Lemont和特青的苗期耐冷性具有极显著差异,Lemont的苗期耐冷性很强,而特青对低温敏感。在重组自交系群体中,苗期耐冷性表现为连续变异,在两个方向上均出现大量超亲分离。共检测到5个水稻苗期耐冷性QTL,分别位于水稻1、3、8和11号染色体上,单个QTL对性状的贡献率为7％～21％。其中,4个QTL的增效基因来源于亲本Lemont,另1个QTL的增效基因来源于亲本特青。2个主效QTL(qSCT-3和qSCT-8)分别位于3号染色体标记区间RM282-RM156和8号染色体标记区间RM230—RM264,对性状的贡献率达到或接近20％,被检测到的LOD值显著较高,其增效基因均来自于耐冷性亲本Lemont。研究结果进一步揭示了水稻苗期耐冷性QTL具有丰富的位点多样性,表明耐冷性普遍较强的粳稻是发掘苗期耐冷性优异基因的主要稻种资源。     

Cr和As复合污染对水稻幼苗吸收积累Fe,P,As和Cr的影响

通过水培实验,研究As和Cr复合污染在有磷(+P)和无磷(?P)条件下对2个水稻基因型品种(Jin23A和CDR22)生长和吸收积累Fe,P,As和Cr的影响.实验结果表明,As和Cr复合污染可导致水稻茎叶干重下降,但对株高、根长和根干重均影响不大.施P肥可促进水稻生长,提高水稻生物量,缓解水稻的重金属毒害.As和Cr复合污染对水稻植株吸收积累Fe,P,As和Cr的影响不一.加As和加P均导致两个水稻品种茎叶和根中Fe含量下降.As对水稻植株P含量影响不大.P可促进水稻根系对As的吸收,而降低水稻对Cr的吸收积累.加As导致水稻Cr含量提高,尤其水稻根系Cr含量提高更明显.与对照相比,1.0mg/LAs浓度在不加P时分别导致Jin23A和CDR22根系Cr含量提高138.9%和283.6%,加P时则分别为40.2%和154.1%.此外,本文还讨论了Fe,P,As和Cr4种元素在水稻植株体内的迁移情况.     

肥大型运动心脏与慢性压力超负荷病理心脏心功能判别

用超声心动图法对24名力量性专业运动员、33名正常人及21名慢性压力超负荷心脏病患者进行了研究。结果发现:运动心脏组及心脏病组的心脏形态结构指标均显著大于正常心脏组,心脏病组更为显著,且泵功能及心缩功能指标几乎均不低于正常心脏组,甚至有超常现象;而心舒功能指标心脏病组全部均显著低于正常心脏组,运动心脏组也大部显著低于正常心脏组而向心脏病组倾斜。据此认为:(1)肥厚型心脏的高排量,不能除外病理心脏高代偿期的可能性。(2)以“心肌肥厚”为主要特征的肥大型运动心脏与以“大容积”为主要特征的大容积型运动心脏一样,均存在其生理-病理阈限的现实可能性。     

AmpC酶及其分子生物学检测

随着抗生素的大量使用,细菌耐药问题日益突出,其中β-内酰胺类药是临床应用最多的抗生素。而药物被β-内酰胺酶水解灭活是细菌耐药的主要原因。近年来革兰阴性杆菌中,AmpC酶(属Bush-J-M1群)已逐渐成为临床面临的严重治疗问题。本文简要介绍AmpC酶的一般特性,产酶基因的结构、功能和表达调控。另外,与几种传统的检测该酶的方法相比,分子生物学方法准确性高,且特异性好,文中重点介绍了PCR,核酸分子杂交,核酸序列分析等方法。     

产AmpC酶阴沟肠杆菌的基因分析及其耐药性

探讨昆明地区阴沟肠杆菌的耐药性及与结构基因ampC和调节基因ampD的相关性。通过K-B法检测阴沟肠杆菌的药敏情况,头孢西丁三维试验检测AmpC酶,PCR法扩增ampC和ampD基因。结果显示74株阴沟肠杆菌经头孢西丁三维试验检测,产AmpC酶的有17株,检出率为22.3%,而且产酶菌株抗生素敏感率低于非产酶菌株。ampC基因扩增阳性率为89.2%(66/74);64株ampD基因阳性率为86.5%(64/74)。实验证实昆明地区产酶阴沟肠杆菌耐药状况严重,与结构基因ampC和调节基因ampD密切相关。