小鼠胚胎干细胞的培养

目的:建立小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES)的培养方法。方法:制备G418抗性的原代小鼠胚胎成纤维细胞,经丝裂霉素C处理后成滋养层细胞,将小鼠胚胎干细胞复苏后,应用含白血病抑制因子的ES细胞培养液,培养小鼠ES细胞,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态。结果:小鼠胚胎成纤维细胞生长良好,ES细胞呈克隆状生长,且保持未分化状态。结论:建立了小鼠胚胎干细胞培养的有效方法,为下一步基因打靶奠定基础。     

用于胚胎干细胞分离培养的滋养层细胞株的建立

具有发育全能性的胚干细胞在分离培养时必须依赖滋养层细胞~［１］,本研究旨在建议一个可供使用的滋养层细胞株。将小鼠胎仔去头、内脏、四肢后用胰酶消化,用作成纤维细胞的初代培养,２～３６后继代培养,并开始进行选择和株化,获得的继代培养的成纤维细胞可用于制备胚干细胞培养所需滋养层,亦可冷冻保存备用。本实验所建立的小鼠成纤维细胞系,已成功地用于胚干细胞的分离培养,证明可作为分离培养胚干细胞时所需的滋养层细胞来源。     

潮霉素抗性转基因BDF1小鼠模型的建立

目的建立具有潮霉素（hygromycin）抗性转基因BDF1小鼠,用于制备携有hygromycin抗性筛选标志ES阳性细胞克隆的饲养层。方法通过显微注射的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因片段（5.1kb）导入BDF1受精卵雄原核中,共注射169枚受精卵,然后将129枚受精卵细胞植入同期受孕的受体母鼠输卵管内。结果共产生37只转基因小鼠,经PCR和Southern检测获得9只阳性小鼠,对一只子代鼠进行RT-PCR检测证明hyg基因已经在肾、肌肉、脾内表达。结论成功的建立具有潮霉素抗性的BDF1转基因鼠,该模型动物可以为基因敲除研究提供良好的基础条件。     

具潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备

[目的]建立具有潮霉素B(hygromycinB)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2-human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。[方法]通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和southernblot鉴定。[结果]经300ug/ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。[结论]本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定

目的　建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果　经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。     

昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养。方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的最佳浓度和时间;取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h。妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化。结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

小鼠表皮干细胞的分离与培养

目的:探讨体外分离和培养小鼠表皮干细胞和分析表皮干细胞克隆形成能力的方法。方法:采用中性蛋白酶和胰酶消化新生小鼠表皮基底层细胞,将细胞直接接种在细胞瓶中,在无滋养层条件下培育;利用表皮干细胞标记物K15和α6整联蛋白进行免疫荧光鉴定;以小鼠胚胎成纤维细胞作为滋养层与成年小鼠角质细胞共培养,进而分析表皮干细胞的克隆形成能力。结果:新生小鼠表皮干细胞克隆在培养2～3 d后开始形成,细胞核质较小,细胞呈小而圆的形态特征;传代后的细胞可以被K15和α6整联蛋白特异性标记。结论:利用该方法能够实现对小鼠表皮干细胞的体外培养和传代。     

昆明小鼠胚胎干细胞的体外分离培养

利用昆明小鼠13.5dpc的胚胎制备小鼠胚胎成纤维细胞,并以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层;收集3.5dICR小鼠的囊胚和桑椹胚进行体外培养,筛选纯化ES细胞集落,使其稳定传代后,对其形态学和生物学性状进行初步鉴定,获得阳性细胞集落。     

国产丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系转化能力的小鼠胚胎干细胞的分离

应用于胚胎干细胞(embryonic stem cells,ES细胞)培养的国产药物可以降低ES细胞的实验成本。研究中以浙江海正药业生产的丝裂霉素(mitomycin,国药准字H33020786)处理小鼠胎儿成纤维细胞,用于胚胎干细胞建系。并制备饲养层,将小鼠囊胚种植在该饲养层上。4-6天后,挑选形态良好的内细胞团(inner cell mass)来源的克隆在胰酶中进行消化,将消化下来的细胞团块传至新鲜的饲养层上。之后,每2-3天传代一次。结果表明,经该丝裂霉素处理的胎儿成纤维细胞支持具有生殖系嵌合能力的胚胎干细胞的分离。     

白细胞介素-1通过JNK信号通路调控Schlafen2基因的表达

目的：在多效生长因子（Ptn）基因稳定沉默的小鼠胚胎成纤维细胞Ptn-siRNA B/MEF241中,研究白细胞介素-1（IL-1）调控Schlafen2（Slfn2）基因表达的机制。方法：应用Northernblot检测Ptn沉默细胞Ptn-siRNAB/MEF241处于不同生长密度时Slfn2基因的表达变化,以确定Ptn沉默细胞中Slfn2基因的表达是否受到某种分泌性细胞因子的调控;用不同浓度的IL-1α中和抗体及IL-1受体拮抗剂处理Ptn沉默细胞,通过Northern blot检测细胞内Slfn2表达的抑制情况;用不同浓度的IL-1α中和抗体及IL-1受体拮抗剂处理Ptn沉默细胞不同时间,通过Western blot检测细胞中JNK磷酸化水平;Northern blot检测SP600125（JNK/MAPK通路抑制剂）对Ptn沉默细胞中Slfn2基因表达的影响。结果：Ptn沉默细胞中Slfn2基因的表达水平同细胞密度相关;用中和抗体和受体拮抗剂阻断IL-1通路,Slfn2表达受到显著抑制;IL-1受到抑制会影响JNK通路的活化;阻断JNK通路,Slfn2的表达受到显著抑制。结论：IL-1可以通过JNK通路诱导Slfn2的表达。     

不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

BRL条件培养基在ES细胞培养中的应用方法探讨

目的：探讨布法罗大鼠肝细胞条件培养基（Buffalo rat liver cell conditioned medium,BRL）在ES细胞培养中的应用方法。方法：ES细胞复苏后分别培养在BRL条件培养基、小鼠胚胎成纤维细胞饲养层（mouse enbryonic fibroblast,MEF）及合并应用BRL条件培养基和MEF饲养层的环境中,通过细胞计数、拟胚体计数和ES细胞集落边缘细胞分化状态比较ES细胞在三种培养基中生长和分化差异。结果：与BRL组比较,MEF组和BRL＋MEF组细胞生长较快（P＜0.01）,ES细胞集落边缘分化细胞较少;MEF组和BRL＋MEF组无明显差异。结论：在复苏后早期阶段ES细胞培养中,不宜单独应用BRL条件培养基,须用MEF饲养层或合并应用BRL条件培养基和MEF饲养层。     

小鼠精原干细胞在三种培养基中的生长行为

目的：建立小鼠精原干细胞（SSCs）的体外长期培养体系。方法：用分别添加了等量的胶质细胞源神经营养因子（GDNF）、可溶性GFRα1和hFGF的DMEM／F12、KSR和StemPro-34 SFM三种无血清培养基和MEF饲养层分别培养经差异贴壁分选富集的小鼠SSCs,通过形态观察、标志基因的RT-PCR和免疫细胞化学分析检测其SSCs本原。结果：DMEM／F12与KSR可支持小鼠SSCs在体外存活6-7d,而StemPro-34 SFM能能维持SSCs体外增值一个月。结论：StemPro-34 SFM支持小鼠SSCs的体外增殖。     

Studies on Two Factors Affecting the Production of Germline Chimeras by Using HM 1 Cells

ＥＳ细胞系统与基因定位致变相结合,进行基因敲除（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）已成为研究基因在生物体内功能的重要手段。在ＥＳ细胞系的建立、外源基因导入ＥＳ细胞、种系嵌合鼠的获得等三个重要环节中,种系嵌合鼠的获得是最关键的一环。由于ＥＳ细胞系统技术复杂、实验条件要求很高,尽管国际上已报导了上百例的基因敲除（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）实验,但是到目前为止,我国还无一例在国内条件下获得种系嵌合鼠的正式报道。本研究对影响种系嵌合鼠获得的两种因素（饲养层细胞、受体胚胎种类）进行了比较研究,成功地获得了种系嵌合鼠。将ＨＭ１细胞在ＳＴＯ或ＭＥＦ培养层上培养至２１３３代,注射到不同小鼠的囊胚里,经过恢复培养,移植到假孕的昆明白雌鼠子宫内。由于ＨＭ１细胞来源于粟色的的１２９品系,而胚胎供体鼠的毛色为黑或白色,仔鼠出生一周后即可辨别是否为毛色嵌合鼠。用成年嵌合鼠与其受体胚胎相同品系的小鼠交配,进行种系嵌合鼠鉴定。曾有报导：ＳＴＯ培养层会导致ＥＳ细胞发生核变。我们改用ＭＥＦ培养层,获得嵌合鼠的比率高达４８．６％（Ｔａｂｌｅ１）。不同小鼠胚胎之间存在差异,Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＩＣＲ和昆明白三者提供的受体胚胎产生嵌合鼠的比率分别为７１．４％、５５％     

Effects of feeder layer and BRL conditioned medium on mouse embryonic stem cells

In vitro growth and maintenance of embryonic stem (ES) cell lines derived from ICM cells of various blastocysts of 129 strain mice,the sustenance of their pluripotency and normal karyotype depend on the feeder layer of mouse embryonic fibroblasts (MEF).Compared with the feeder layer of MEF cells,medium conditioned by Buffalo rat liver cells (BRL-CM) is able to maintain pluripotency and karyotypic normality of ES cells only in short term cell propagation.Besides,ES cells grown in BRL-CM are also capable of aggregation with 8-cell embryos of Swiss strain and develop into germ line chimaeras.Modification to the method of aggregating ES cells with early embryos by making a hole in agar layer on the top of MEF feeder cells was shown to be more converient and efficient than the conventional microdrop method.     

Feeder cell density—A key parameter in human embryonic stem cell culture

Summary A key issue in human embryonic stem (ES) cell culture that has largely been ignored is the high degree of variability in the murine embryonic fibroblast (MEF) feeder cell density, which has been reported by different studies and protocols. Presumably, too low a feeder cell density would result in insufficient levels of secreted factors, extracellular matrix, and cellular contacts provided by the feeder cells for the maintenance of human ES cells in the undifferentiated state. Too high a feeder cell density, on the other hand, may result in a more rapid depletion of nutrients and oxygen within the in vitro culture milieu, as well as physically hinder the attachment and growth of ES colonies during serial passaging. Preliminary investigations by our group revealed that an elevated MEF cell density of 32,000 cells/cm², above the recommended value of 20,000 cells/cm², appeared to be highly detrimental to the attachment and growth of serially passaged ES colonies of the H9 line (WiCell Research Institute Inc., Wilmington, MA, USA). At the edge of ES colonies that have attached to the higher density feeder layer (32,000 cells/cm²), the ES cells appear to stack up to form a “bulge.” This was not observed under the recommended feeder cell density of 20,000 cells/cm². By contrast, other established ES cell lines are routinely propagated at much higher feeder densities of 60,000 to 70,000 cells/cm². This report briefly discusses the issue of MEF feeder cell density in relation to our preliminary observations, and the results of other studies.     

一种新的人胚胎干细胞无饲养层培养方法的建立

目的:以转染碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞株(FLSC)培养人胚胎干细胞(hESC),寻找更加安全、有效的体外培养扩增方法。方法:通过ELISA方法定量检测转基因的人FLSC条件培养基中bFGF的分泌量;以商业化的mTeSR1无血清无饲养层培养基、常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基,以及转染bFGF的人FLSC条件培养基(bFGF/FLSC-CM)分别培养扩增H9细胞。通过观察hESC形态、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR,检测hESC全能性标志物的表达。结果:ELISA方法检测bFGF/FLSC-CM中bFGF因子的分泌量为(770.09±17.28)pg/mL,而MEF-CM中bFGF因子的分泌量为(55.59±0.61)pg/mL,两者存在显著差异(P0.01);在3种培养体系下,免疫荧光检测hESC全能性标志Oct-4、Tra-1-81抗体的表达均呈阳性,流式检测细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)抗体阳性细胞的比例均在99%左右;RT-PCR检测到hESC特异的转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的表达。结论:以转染bFGF的人FLSC条件培养基可以有效扩增hESC,可为临床应用提供一种安全、高效、低成本的无饲养层培养方法。     

FGF2 secreting human fibroblast feeder cells: a novel culture system for human embryonic stem cells

Human embryonic stem cell (hESC) lines are traditionally derived and maintained on mouse embryonic fibroblasts (MEF) which are xenogeneic and enter senescence rapidly. In view of the clinical implications of hESCs, the use of human fibroblast as feeders has been suggested as a plausible alternative. However, use of fibroblast cells from varying sources leads to culture variations along with the need to add FGF2 in cultures to sustain ES cell pluripotency. In this study we report the derivation of FGF2 expressing germ layer derived fibroblast cells (GLDF) from hESC lines. These feeders could support the pluripotency, karyotypes and proliferation of hESCs with or without FGF2 in prolonged cultures as efficiently as that on MEF. GLDF cells were derived from embryoid bodies and characterized for expression of fibroblast markers by RT-PCR, Immunofluorescence and by flow cytometry for CD marker expression. The expression and secretion of FGF2 was confirmed by RT-PCR, Western blot, and ELISA. The hESC lines cultured on MEF and GLDF were analyzed for various stemness markers. These feeder cells with fibroblast cells like properties maintained the properties of hESCs in prolonged culture over 30 passages. Proliferation and pluripotency of hESCs on GLDF was comparable to that on mouse feeders. Further we discovered that these GLDF cells could secrete FGF2 and maintained pluripotency of hESC cultures even in the absence of supplemental FGF2. To our knowledge, this is the first study reporting a novel hESC culture system which does not warrant FGF2 supplementation, thereby reducing the cost of hESC cultures.