α-酮戊二酸依赖型双加氧酶催化特性及反应耦联辅因子对其催化羟基化反应的影响

【目的】以重组大肠杆菌表达的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)L-异亮氨酸双加氧酶(L-isoleucine dioxygenase,IDO)为研究对象,考察其催化L-异亮氨酸(L-Ile)羟基化反应的影响因素,构建IDO催化合成羟基氨基酸的反应体系。【方法】通过Ni-NTA亲和层析法从重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/p ET28a-ido中纯化获得重组IDO,以L-Ile为底物,考察重组IDO催化羟基化反应的影响因素,并进一步针对耦联反应优化α-酮戊二酸(α-KG)在重组IDO酶促转化体系中的添加浓度。【结果】基于重组IDO催化L-Ile羟基化的活性测定,计算该酶Km为0.247 mmol/L,kcat为1.260 s-1,kcat/Km为5.101 L/(mmol·s),与其他同源酶动力学参数比较分析表明,重组IDO的底物亲和性及催化效率较高。重组IDO催化反应的最适温度为20°C、最适p H为7.0;在35°C以下较为稳定;反应体系中Fe2+最适浓度为1 mmol/L。重组IDO可催化不同L-氨基酸反应,对L-异亮氨酸、L-正亮氨酸、L-甲硫氨酸的活性较高。通过优化α-KG浓度,反应体系中添加30 mmol/Lα-KG时,可将底物浓度提高至70 mmol/L,产物4-羟基异亮氨酸(4-HIL)的摩尔产率达66.20%,表明α-KG作为反应耦联辅因子,其浓度对重组IDO催化L-Ile羟基化具有显著影响。【结论】重组IDO的底物亲和性、催化效率、最适催化条件、稳定性等基本性质有利于催化L-Ile羟基化反应。在其催化反应体系中,α-KG作为反应耦联辅因子,对酶促转化效果影响显著。研究结果为4-HIL及其他羟基氨基酸的酶促转化提供了研究基础。     

两相分配法制备南极红酵母质膜

用葡聚糖 T-500(Dextran T-500)和聚乙二醇(PEG-3350)两相体系制备南极红酵母(Rhodotorula sp.)菌株 NJ298 的质膜.首先在 2 mmol/L KCl 浓度下,选用5种不同的聚合物浓度(5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4%,W/W),研究了 NJ298 质膜在两相体系中的分配情况,在此基础上进一步研究了 KCl 浓度(2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L)对 NJ298 质膜的纯度及得率的影响.结果表明,选用6.0%聚合物浓度,4 mmol/LKCl 的两相分配体系,分离3次可得到相对纯度在 78.2%的南极红酵母质膜组分,标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡.这为进一步研究该菌株的南极极端环境适应机制奠定了基础.     

一株乙二醇氧化酶菌株的筛选及催化特性的初步研究

利用富集培养技术从土壤中筛选获得1株高活性二醇氧化活性菌株Brevibacterium sp.CCZU12-1。以Brevibacterium sp.CCZU12-1静息细胞为催化剂,最适催化反应温度、反应pH和金属离子添加量分别为30℃、6.5和Mn2＋0.1 mmol/L。在最佳条件下,转化200 mmol/L乙二醇24 h,羟基乙酸的产率为94.6%,分批补料乙二醇5批,羟基乙酸的累积浓度为972 mmol/L。     

褐飞虱共生解脂假丝酵母抗吡虫啉菌株的驯化

为进一步研究共生菌在褐飞虱对吡虫啉产生抗性中的生理生化机制,在稻田杀虫剂对褐飞虱共生解脂假丝酵母生长影响的基础上,选用不同吡虫啉浓度进行抗药性菌株的驯化。结果表明,褐飞虱共生解脂假丝酵母在不同吡虫啉浓度(2 000、1 000和500 mg/L)的固体培养基上继代培养,经过20代后2 000 mg/L培养基上的共生菌菌落数量,与未加吡虫啉的培养基上的菌落数量差异不明显,并且连续3代稳定后定为抗2 000 mg/L吡虫啉的共生菌菌株。在光镜下比较不同抗感吡虫啉菌株假菌丝的形态变化,发现抗吡虫啉菌株的假菌丝出现畸形,而且假丝变短,部分出现了膨大。     

两相分配法制备南极红酵母质膜

用葡聚糖T-500(Dextran T-500)和聚乙二醇(PEG-3350)两相体系制备南极红酵母(Rhodotorula sp.)菌株 NJ298的质膜。首先在2 mmol/L KCl浓度下, 选用5种不同的聚合物浓度(5.6%、5.8%、6.0%、6.2%、6.4 %, W/W), 研究了NJ298质膜在两相体系中的分配情况, 在此基础上进一步研究了KCl浓度(2 mmol/L、4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L、10 mmol/L)对NJ298质膜的纯度及得率的影响。结果表明, 选用6.0%聚合物浓度, 4 mmol/L KCl的两相分配体系, 分离3次可得到相对纯度在78.2%的南极红酵母质膜组分, 标志酶鉴定及磷钨酸染色电镜检测均表明获得了高纯度密实的正向型的质膜囊泡。这为进一步研究该菌株的南极极端环境适应机制奠定了基础。     

胆固醇转化菌株的筛选及发酵条件优化

【目的】从土壤中筛选及鉴定具有转化胆固醇能力的菌株SE-1,对转化产物进行结构鉴定,并通过一定的工艺条件优化提高转化产率。【方法】利用胆固醇为唯一碳源筛选能转化胆固醇的菌株SE-1,对菌株进行形态、生理生化特征试验及16S rRNA基因序列同源性分析确定该菌株的系统发育学地位。发酵转化产物经氯仿萃取,对转化产物进行硅胶板薄层层析法分析,用硅胶柱层析法、Sephadex LH20分离产物,通过1H-NMR、13C-NMR分析确定转化产物的化学结构。对菌株转化胆固醇的发酵培养基的碳源、氮源、底物添加方式及发酵条件进行优化。【结果】菌株SE-1为革兰氏阴性菌,生理生化特征与洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)相似,16S rRNA序列与洋葱伯克霍尔德氏菌(GenBank No.U96927)相似性为99%。硅胶薄层层析显示转化产物为两种产物。发酵转化时,在胆固醇-吐温乳化液的添加量为1 g/L,碳源糖蜜5%,氮源(NH4)2SO40.3%,接种量4%,发酵液pH7.5,36℃发酵的条件下,7β-羟基胆固醇的产率最高,达到34.4%。【结论】分离得到的菌株SE-1鉴定为Burkholderia cepacia。菌株SE-1转化胆固醇的主产物为7β-羟基胆固醇,次产物为7-酮基胆固醇,胆固醇7β-羟基化转化率在最适的转化条件下比优化前提高了20.8%。     

操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物

【目的】操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶,生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。【方法】构建了4个茶树类黄酮3′-羟基化酶基因(CsF3′H)和拟南芥的P450还原酶基因(ATR)融合表达质粒:SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR2[75-711]3 AA,分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21,获得12个转化菌株S1–S12;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒p YES-Dest52-CsF3′H,转化酵母菌株WAT11,得到转化菌株S13;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒pES-URA-CsF3′H,及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因At FLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H::At FLS 9AA,二者共转化酵母菌株WAT11,获得转化菌株S14。【结果】转化SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25°C条件下发酵,转化效率最高,能将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,分别转化生成287.93μmol/L圣草酚、131.76μmol/L二氢槲皮素和188.62μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,最多能转化生成734.32μmol/L圣草酚、446.07μmol/L二氢槲皮素和594.64μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素,在发酵36–48 h中,最多能生成1412.16μmol/L圣草酚、490.25μmol/L山奈酚、445.75μmol/L槲皮素、66.75μmol/L二氢槲皮素和73.50μmol/L二氢山奈酚。【结论】本研究首次将茶树类黄酮3′-羟基化酶基因应用于B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。     

一株吡虫啉杀虫剂降解菌BB-1的分离鉴定

目的:从福建安溪茶园土壤分离能降解吡虫啉杀虫剂的细菌菌株,对其进行分类鉴定.方法:采用室内培养试验方法,通过富集驯化、平板划线分离得到1株优势细菌BB-1,采用形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析对菌株BB-1进行鉴定.结果:菌株BB-1 与多株苍白杆菌(Ochrobactrum)的亲缘关系最近,该菌株鉴定为苍白杆菌属(Ochrobactrum sp.).BB-1在吡虫啉浓度为400mg/L的LB培养基中培养0h～5h为生长延迟期,4h～20h为对数生长期,20h～42h为稳定期,42h以后为衰亡期.菌株BB-1对多种抗生素敏感,可耐受的NaCl浓度超过10%.结论:BB-1能降解吡虫啉杀虫剂,分类上应属于Ochrobactrum sp..     

一株转化4-羟基-2-丁酮为1，3-丁二醇微生物菌株的筛选及鉴定

从本实验室保藏的86株酵母菌株中筛选到20株利用4-羟基-2-丁酮（4H2B）生产1,3-丁二醇（1,3-BDo）的菌株,当转化液中4H2B浓度为10g/L时,经初步测定1,3．BDO含量,其中菌株32 1,3-BDO产量最高达6．5g/L,具有较好的1,3-BDO生产潜力。对其进行形态学和常规生理生化鉴定实验,并结合18S rDNA基因分析,比对结果表明,菌株32与Pichia farinosa strain DC 3343相似性达99．8％,为Pichia farinosa的一个亚种。     

6-羟基烟酸3-单加氧酶(NicC)催化反应机理研究

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440中的6-羟基烟酸(6HNA)3-单加氧酶(NicC)是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行活化,从而使吡啶环可在双加氧酶催化下开环,最终被完全降解。通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量,进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现,NicC的最适反应温度为30～40℃,最适反应pH为8.0。Cd~(2+)对NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25mmol/L时,底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1U/mg,K_m值为51.8μmol/L;当6HNA的浓度为0.25mmol/L时,底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79U/mg,K_m值为15.0μmol/L。通过HPLC和LC-MS分析表明,NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶(2,5-DHP)和甲酸,还可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明,产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。     

Microbial hydroxylation of imidacloprid for the synthesis of highly insecticidal olefin imidacloprid

Microorganisms that bring about the aerobic transformation of imidacloprid (IMI) were isolated and screened, and the microbial regio- and stereoselective hydroxylation of IMI was studied. Some bacteria and fungi transformed IMI to 5-hydroxyl IMI. Bacterium Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788 resting cells transformed IMI into R-5-hydroxyl IMI at the highest conversion rate. The enzyme catalyzed the stereoselective hydroxylation at position C12 of IMI in the imidazolidine ring. Under acidic conditions, 5-hydroxyl IMI was converted into olefin IMI in high molar conversion yield. The olefin IMI exhibited about 19 and 2.2 times more insecticidal efficacy than IMI against horsebean aphid imago and nymph, respectively, and about 1.4 times more active than IMI against brown planthopper imago. The transformation rate of IMI by resting cells of S. maltophilia CGMCC 1.1788 was promoted significantly by some carbohydrates and organic acids. The reaction medium with 5% sucrose resulted in 8.3 times greater biotransformation yield as compared with that without sucrose.     

N-demethylation of neonicotinoid insecticide acetamiprid by bacterium <Emphasis Type="Italic">Stenotrophomonas </Emphasis><Emphasis Type="Italic">maltophilia</Emphasis> CGMCC 1.1788

Our previous study found that Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788 could hydroxylate imidacloprid (IMI) to 5-hydroxy IMI. Here we first report that S. maltophilia CGMCC 1.1788 can demethylate acetamiprid (AAP) to form IM 2-1 that was characterized by HPLC-MS/MS and NMR. IM 2-1 retained only 10.5% contact activity and 13.1% oral activity of AAP against horsebean aphid. Time course of biotransformation under existing of sucrose revealed that 58.9% of AAP disappeared, but only 16.7% of reduced AAP was transformed to IM 2-1, after 8 days. Both demethylation and degradation of AAP contribute to the weak bioefficacy of AAP in soil application. The differences in metabolism and detoxification pathways between AAP and IMI are probably originated from the structural differences of these insecticides.     

Enhanced hydroxylation of imidacloprid by <Emphasis Type="Italic">Stenotrophomonas maltophilia</Emphasis> upon addition of sucrose

Sucrose’s ability to promote the hydroxylation of imidacloprid (IMI) by bacterium Stenotrophomonas maltophilia strain CGMCC 1.1788 was examined. Both growing culture and resting cells could transform IMI into 5-hydroxy IMI. Adding 2% sucrose to the growing culture transformation broth and 5% sucrose to the resting cell transformation broth resulted in biotransformation yields, respectively, 2.5 and 9 times greater than without sucrose. In the growing culture transformation, sucrose increased biomass, which led to enhance hydroxylation of IMI. In the resting cell transformation, sucrose was used not as a carbon source but as an energy source for cofactor regeneration for hydroxylation of IMI. The hydroxylation activity of IMI was promoted eightfold by adding reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) to the cell-free extract. The hydroxylation of IMI was significantly inhibited by P450 inhibitor piperonyl butoxide. It seems that the hydroxylation of IMI by S. maltophilia CGMCC 1.1788 might proceed through a system by cooperating with P450 enzyme.     

用基因工程菌酶法和化学法制备-D-对羟基苯甘氨酸(英文)

D 对羟基苯甘氨酸 (D p HPG)是制备羟氨苄青霉素、羟氨苄头孢菌素和羟氨唑头孢菌素等β 内酰胺类抗生素的重要中间体 ,同时它也用于多种多肽类激素及农药的合成 .在D 对羟基苯甘氨酸的多种制备方法中 ,生物酶转化法具有原料易得、工艺简单、耗能少、产率高、成本低、光学纯度好、三废污染少等优势 .为利用生物酶转化法制备D 对羟基苯甘氨酸 ,首先用尿素、乙醛酸和苯酚合成底物D ,L 对羟基苯海因 ,然后利用D 海因酶基因工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht细胞作酶源 ,进行底物D ,L 对羟基苯海因到中间体N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸的酶法转化 ,最后用化学法将N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸进一步转化为D 对羟基苯甘氨酸 .结果表明 ,底物D ,L 对羟基苯海因的收率为 60 % .8L体积的发酵小试实验表明 ,发酵 12h ,工程菌E .coliBL2 1 pMD T7 dht的海因酶活力为 30 0 0U L ,SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳薄层扫描结果显示海因酶表达量约占菌体总可溶性蛋白质的 60 % ,菌体收率为 6% .8L体积的海因酶转化实验表明 ,在 4 %底物D ,L 对羟基苯海因和 1%菌体 (湿重 )pH 9 0情况下 ,反应 5h ,D ,L 对羟基苯海因的转化率可达 96% .在酸性条件下 ,用NaNO2 将N 氨基甲酰 D 对羟基苯甘氨酸转化为D 对羟基苯甘氨酸 ,反应 2h ,转     

微生物转化方法生产香草酸与香草醛的初步研究

从实验室保藏的菌种中筛选到一株黑曲霉（Aspergillus niger）SW-33,能够将1g/L的阿魏酸底物转化为0.23g/L的香草酸,相应的摩尔转化率为29.35％;流加四次底物阿魏酸后,产物浓度达到1.11g/L,相应的摩尔转化率为44.9％。为了提高产物浓度,对培养基和发酵条件进行优化,使得该菌株能够将1g/l的阿魏酸底物转化为0.46g/L的香草酸,相应的摩尔转化率为57.81％。提取得到的香草酸,经HPLC测定,纯度为85.9％;提取收率为75.2％。用含香草酸的转化液,或者用提取的结晶香草酸,加入朱红密孔菌（Prcnporus cinnabarnus）SW-0203发酵培养液,可得到转化产物香草醛。     

固定化细胞有机相催化不对称还原β-羰基酯

将酵母细胞用海藻酸钙包埋后用于有机相催化不对称还原4-氯乙酰乙酸乙酯制备光学活性的4-氯-3-羟基丁酸乙酯,从中筛选得到具有较高立体选择性和还原能力的菌株假丝酵母SW0401,将此菌株的细胞固定化细胞作为研究对象,系统考察了固定化条件、固定化细胞大小、反应溶剂、初始底物浓度、辅助底物、固定化细胞热处理和抑制剂对还原反应的影响。结果表明,上述因素对反应的摩尔转化率和产物（S）-CHBE光学纯度有显著影响。固定化时所用缓冲液的pH值为7．0时和固定化细胞颗粒平均直径为2.5mm较合适,以正己烷为反应介质时反应的摩尔转化率和产物光学纯度最优,初始底物浓度以54.7mmol／L为宜,辅助底物以1-己醇为佳。对固定化细胞的热处理和添加抑制剂烯丙醇均能够明显改善产物的光学纯度,但对提高摩尔转化率有负面影响。     

甲酸脱氢酶在Klebsiella pneumoniae中的表达和功能分析

在甘油厌氧发酵生产1,3-丙二醇的过程中,需要消耗还原当量NADH,NADH的有效供给决定了1,3-丙二醇的产量和得率。采用PCR方法从Candidaboidinii基因组中克隆编码甲酸脱氢酶基因fdh,将fdh基因片段插入载体pMALTM-p2X中,构建表达载体pMALTM-p2X-fdh,并转入1,3-丙二醇生产菌Klebsiella pneumoniae YMU2,获得重组菌Klebsiella pneumoniae F-1。研究了重组质粒的稳定性和IPTG诱导fdh基因过量表达的条件。结果表明,重组质粒具有良好的稳定性;fdh基因表达的蛋白分子量为40.2kDa;IPTG诱导表达研究表明,在IPTG浓度为0.5mmol/L时,诱导4h后甲酸脱氢酶表达明显;发酵过程中甲酸脱氢酶比酶活达到5.47U/mg;与出发菌株K.pneumoniae YMU2相比,重组菌F-1合成1,3-丙二醇的浓度提高了12.5%。     

基于代谢通量分析的琥珀酸放线杆菌高产选育研究

在对产琥珀酸放线杆菌代谢分析的基础上选育出高产突变株对琥珀酸的工业生物转化有重要意义.在矩阵分析代谢通量基础上,围绕柔性节点下的副产物乙酸及乙醇的降低分别实施软X诱变及定点突变选育,并对比分析了突变株与出发株相关酶活及基因序列变化.针对出发株的流量分析显示产物琥珀酸的代谢通量为1.78(mmol/g/h),主要副产物乙酸与乙醇的代谢通量分别为(0.60mmol/g/h)和(1.04 mmol/g/h),并发现乙醇代谢加剧了琥珀酸合成中的H电子供体的不足;筛选出的氟乙酸抗性突变株S.JST1的乙酸代谢通量降低了96%,为0.024(mmol/g/h),酶活检测表明磷酸乙酰转移酶(Pta)的酶比活力从602降低到74,进一步的序列对比分析发现pta突变基因中产生了一个突变位点:adh定点复合突变株S.JST2的乙醇代谢通量降低了98%,为0.020(mmol/g/h),酶活检测表明Adh的酶比活力从585降低到62.最终突变株S.JST2琥珀酸累积产量达65.7 g/L.围绕产琥珀酸放线杆菌Pta及Adh酶活的降低实施定向选育,在降低副产物流量的同时,有助于改善细胞H供体代谢平衡进而提高琥珀酸的流量.所获突变株具有工业应用潜力.     

还原亚硒酸盐产生红色单质硒光合细菌菌株的筛选与鉴定

从实验室保藏的光合细菌中筛选出一株对亚硒酸钠还原效率较高的菌株S3,其亚硒酸钠还原产物通过透射电子显微镜及EDX(Electron-Dispersive X-ray)分析确定为红色单质硒。菌株S3的形态学特征、生理生化特征及光合色素扫描结果与固氮红细菌(Rhodobacter azotoformans)的特征基本一致;16S rDNA序列(GenBank登录号为DQ402051)在系统发育树中与固氮红细菌同属一个类群,序列同源性为99%。根据上述结果将菌株S3鉴定为固氮红细菌。初步研究了该菌株还原亚硒酸钠的特性,首次报道固氮红细菌具有还原亚硒酸盐产生红色单质硒的能力,为今后利用微生物方法治理环境中硒污染、利用微生物方法获得活性红色单质硒以及对微生物还原亚硒酸盐产生红色单质硒的机理研究奠定了良好的基础。     

（R）与（S）-羰基还原酶偶联一步法制备（S）-苯乙二醇

【目的】通过 (R) - 和(S) -羰基还原酶在大肠杆菌中偶联,实现了一步法制备（S）-苯乙二醇的生物转化过程。【方法】将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis CCTCC M203011)的(R)- 羰基还原酶基因（rcr）和(S) -羰基还原酶基因（scr）串联于共表达载体pETDuetTM-1上。重组质粒pETDuet-rcr-scr转化稀有密码子优化型菌株Escherichia coli Rosetta,获得酶偶联重组菌株E. coli Rosetta / pETDuet-rcr-scr。当重组菌体培养至OD600 0.6-0.8时,添加终浓度1 mmol/L IPTG,30℃诱导蛋白表达10 h。【结果】SDS-PAGE结果表明(R)- 和(S) -羰基还原酶均明显表达,它们的相对分子质量分别为37 kDa和30 kDa。重组菌生物转化结果表明：在pH7.0的磷酸缓冲液中,添加5 mmol/L Zn2+时,获得产物(S)-苯乙二醇,产物光学纯度为91.3% e.e.,产率为75.9%。【讨论】采用分子重组技术成功整合了两种氧化还原酶的催化功能,实现了(S)- 苯乙二醇的一步法转化,为简化手性醇制备途径提供了一条崭新的思路。