操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物

【目的】操纵茶树类黄酮3′-羟基化酶,生物合成B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素。【方法】构建了4个茶树类黄酮3′-羟基化酶基因(CsF3′H)和拟南芥的P450还原酶基因(ATR)融合表达质粒:SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA、SUMO-CsF3'H[7-517]::ATR2[75-711]3 AA和SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR2[75-711]3 AA,分别转化大肠杆菌菌株TOP10、DH5α和BL21,获得12个转化菌株S1–S12;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒p YES-Dest52-CsF3′H,转化酵母菌株WAT11,得到转化菌株S13;构建了茶树类黄酮3′-羟基化酶基因CsF3′H表达质粒pES-URA-CsF3′H,及茶树黄烷酮3-羟基化酶基因CsF3H与拟南芥黄酮醇合成酶基因At FLS的融合表达质粒pES-HIS-CsF3H::At FLS 9AA,二者共转化酵母菌株WAT11,获得转化菌株S14。【结果】转化SUMO-CsF3'H[28-517]::ATR1[49-688]3 AA质粒的TOP10菌株S6在25°C条件下发酵,转化效率最高,能将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,分别转化生成287.93μmol/L圣草酚、131.76μmol/L二氢槲皮素和188.62μmol/L槲皮素。发酵菌株S13能分别将1000μmol/L柚皮素、二氢山奈酚和山奈酚,最多能转化生成734.32μmol/L圣草酚、446.07μmol/L二氢槲皮素和594.64μmol/L槲皮素。喂食S14发酵菌株5 mmol/L的底物柚皮素,在发酵36–48 h中,最多能生成1412.16μmol/L圣草酚、490.25μmol/L山奈酚、445.75μmol/L槲皮素、66.75μmol/L二氢槲皮素和73.50μmol/L二氢山奈酚。【结论】本研究首次将茶树类黄酮3′-羟基化酶基因应用于B环-3′,4′-二羟基黄酮类化合物圣草酚、二氢槲皮素和槲皮素的生物合成。     

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR法扩增出茶树中巯基蛋白酶抑制剂基因(Tea cystatin,TC)cDNA编码区序列,定向克隆到表达载体pET 32 a( )上,得到重组质粒pET-TC,在表达宿主菌BL21 trxB(DE3)中高效表达,产生分子量约为31.8 kD a的特异融合蛋白。实验表明:随着诱导时间的延长,表达的融合蛋白Trx-TC的产量逐渐增加,特异蛋白的表达量最高可占菌体总蛋白的35.4%;在15℃、25℃、30℃和37℃四个不同诱导温度下,均能诱导产生融合蛋白;IPTG终浓度在0.5 mm ol/L~5 mm ol/L范围内均能诱导产生融合蛋白,表达的产物主要以可溶性蛋白形式存在。另外,体外酶促反应表明表达的融合蛋白Trx-TC对木瓜蛋白酶有明显的抑制活性。     

不同栽培模式对茶园生态环境及茶叶品质的影响

对陕南茶区的纯茶园、塑料大棚茶园、松茶间作茶园及林篱茶园4种常见栽培模式的茶园生态环境(包括小气候因子、土壤因子)和茶叶中各项生化指标(包括氨基酸、咖啡碱、茶多酚、酚氨比、茶水浸出物)进行了测定.结果表明:不同栽培模式茶园小气候因子有显著差异.相对于纯茶园,塑料大棚茶园、松茶间作茶园和林篱茶园能更有效地改善光照条件、降低环境温度、提高土壤水分和有机质含量、增强空气湿度,提高土壤养分状况.3种复合式茶园茶叶品质也较纯茶园显著提高,氨基酸和茶水浸出物含量显著高于纯茶园茶叶,而茶多酚含量却显著低于纯茶园茶叶.因此,林茶复合栽培模式和大棚模式茶园的生态环境更有利于茶树的生长和茶叶品质的提高.