6-羟基烟酸3-单加氧酶(NicC)催化反应机理研究

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440中的6-羟基烟酸(6HNA)3-单加氧酶(NicC)是烟酸代谢过程中的关键酶。NicC通过在吡啶环上加羟基对吡啶环进行活化,从而使吡啶环可在双加氧酶催化下开环,最终被完全降解。通过去除NicC的N端稀有密码子增加了NicC的表达量,进一步利用Ni-Sepharose重力柱对NicC进行了纯化。通过实验发现,NicC的最适反应温度为30～40℃,最适反应pH为8.0。Cd~(2+)对NicC的酶活有明显的抑制作用。当NADH的浓度为0.25mmol/L时,底物6HNA所对应的NicC的最大酶活为14.1U/mg,K_m值为51.8μmol/L;当6HNA的浓度为0.25mmol/L时,底物NADH所对应的NicC的最大酶活为10.79U/mg,K_m值为15.0μmol/L。通过HPLC和LC-MS分析表明,NicC可以在NADH和氧气的参与下催化6HNA转化生成2,5-二羟基吡啶(2,5-DHP)和甲酸,还可以将对羟基苯甲酸转化生成对苯二酚。同位素标记实验表明,产物2,5-DHP中的氧原子来源于参与反应的氧气。为研究吡啶类化合物微生物代谢提供了理论基础。     

利用荧光染色和流式细胞技术辅助卵孢小奥德蘑原生质体制备与再生研究

本研究以卵孢小奥德蘑液体培养菌丝作为实验材料,利用单因子变量法探索研究了菌丝培养时间、酶浓度、酶解时间、酶解温度、稳渗剂类型对卵孢小奥德蘑原生质体制备的影响,并对原生质体再生培养基进行选择和优化。通过荧光染色,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪对原生质体的制备过程、得率和活力进行研究。结果表明,将卵孢小奥德蘑菌丝在液体培养基中培养5d收集菌丝体,以甘露醇作为渗透压稳定剂,在溶壁酶浓度2%、30℃条件下酶解5h,获得的原生质体得率最高,达2.0×10 ⁷个/mL;通过流式细胞仪分析,约57.69%的原生质体细胞为活细胞;在RM培养基中再生效果最好,再生率为(0.103±0.025)%。研究结果可以为卵孢小奥德蘑育种与食用菌原生质体制备再生提供研究基础。     

混合菌群DBFC对二苯并呋喃的降解特性及其代谢途径

[目的] 二苯并呋喃（DBF）是研究多环芳烃降解过程的模式化合物,研究其代谢过程和代谢途径对于阐明多环芳烃的代谢机制有重要意义。[方法] 从辽河河口区石油污染土壤中筛选到1个高效降解DBF的混合菌群DBFC。提取总DNA对菌群的生物多样性进行分析,通过稀释涂布平板法对菌株进行分离纯化。通过测定OD₆₀₀的吸收值对混合菌群的最适生长条件进行研究。在最适生长条件下研究底物浓度、底物谱、营养物质及表面活性剂对菌群降解效率的影响。利用超高分辨质谱检测混合菌群降解DBF的中间代谢物质,并推测其代谢途径。[结果] 生物多样性分析表明该混合菌群的组成为类芽孢杆菌（84.06%）、无色杆菌（8.17%）、假单胞菌（0.77%）、其他菌株（2.13%）。分离得到苍白杆菌、无色杆菌、寡养单胞菌和细杆菌。生长测定结果显示苍白杆菌、无色杆菌、寡养单胞菌和细杆菌均不能在DBF培养基中生长。混合菌群DBFC的最适生长条件为30℃、pH 8.0。在该条件下,混合菌群DBFC能将1.0 g/L的DBF在8 d内完全降解。在DBF浓度1.0 g/L条件下,混合菌群DBFC的最大降解速率为0.031 mmol/（L·h）。在培养基中添加葡萄糖、酵母粉和蛋白胨能将菌群降解DBF的效率分别提高1.38倍、1.14倍和1.24倍。在培养基中添加十二烷基磺酸钠或Triton-X-100能够抑制混合菌群降解DBF的效率。利用超高分辨质谱检测到4种中间代谢物质（2,2'',3-三羟基联苯、2,4-已二烯酸、龙胆酸和水杨酸）,并推测了DBF代谢途径。[结论] 本研究分离到高效DBF降解菌群,该菌群能在碱性（pH 8.0）条件下完全降解DBF,为该类污染物的原位修复提供优良菌系;利用超高分辨质谱分析得到了DBF降解途径,为该类物质的混合菌群代谢研究提供了参考。     

Arthrobacter sp.2PR降解2-羟基吡啶动力学及降解特性研究

从辽河口石油污染土壤中筛选到一株能够以2-羟基吡啶作为唯一碳源、氮源和能源进行生长的菌株2PR,基于形态学观察、16S rRNA基因序列分析鉴定菌株2PR属于节杆菌属(Arthrobacter)。菌株2PR生长和降解2-羟基吡啶的最适条件是30℃,pH为7.0。当2-羟基吡啶初始浓度为6.0mg/ml时,120h菌株2PR对2-羟基吡啶的降解效率为94.48%,初始2-羟基吡啶浓度为8.0mg/ml时,156h的降解效率为89.21%。对2-羟基吡啶降解动力学过程进行模拟,结果显示菌株2PR生长和降解过程符合logisitic模型,该模型为环境中2-羟基吡啶的生物降解提供了理论参考。休止细胞反应和中间代谢产物检测表明,菌株2PR在降解2-羟基吡啶的过程中生成了蓝色化合物4,5,4',5'-tetrahydroxy-3,3'-diazadiphenoquinone-(2,2')。推测该菌株降解2-羟基吡啶的途径可能是首先由双加氧酶催化生成2,3,6-三羟基吡啶,后者会自发形成蓝色中间代谢产物,2,3,6-三羟基吡啶发生开环反应,最终被完全降解。菌株2PR是已报道菌株中2-羟基吡啶耐受能力和降解能力最强的菌株,在污染物生物修复方面具有广阔的应用前景。