在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3．1和2．1kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上（1）去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;（2）将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中（3．1kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中,低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换。将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第1内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常,从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因。     

用于筛选直链淀粉含量为中等的籼稻品种的分子标记

用PCR AccⅠ分子标记检测方法 ,检测了来自不同地区的 6 3个栽培水稻品种 (系 )蜡质基因第 1内含子剪接供体 1位碱基是G或是T。另外 ,还测定了这些水稻成熟种子的直链淀粉含量。结果显示该位置是G碱基的水稻品系成熟种子中直链淀粉含量均高于 2 0 % ,该位置是T的均低于 18%。在杂交育种过程中 ,这一分子标记可用于预测水稻植株种子的直链淀粉含量。对高直链淀粉含量的水稻亲本与中等直链淀粉含量的水稻亲本之间 5个籼型杂交组合F2 群体的分析表明 ,蜡质基因第 1内含子 1位碱基是G或是T与水稻种子中直链淀粉含量的高或低是紧密连锁 ,共同分离的。这些结果表明PCR AccⅠ分子标记检测方法可用于选育中等直链淀粉含量的籼稻新品系     

糯性水稻中蜡质基因第1内含子的剪接活性

以前的研究结果表明 ,非糯性的稻米中直链淀粉的含量与各品种中蜡质基因 (Wx)第 1内含子被剪接的效率有关 ,即剪接效率高的品种直链淀粉含量也高。为弄清糯米中不含直链淀粉是否也与此内含子剪接效率有关系 ,构建了蜡质基因启动子 (来自籼稻品种2 32 )、蜡质基因第 1内含子 [来自籼稻品种 2 32 (高直链淀粉含量的品种 )或粳稻品种寒丰 6 36 6 (中、低直链淀粉含量的品种 ) ]与GUS报告基因组成的两种嵌合基因 ,将含有这两种嵌合基因的质粒分别转化进粳性糯稻品种奉糯 5 93中 ,同时还分别转化进非糯性的籼稻品种特青和粳稻品种中花 11中作为对照 ,测定它们的抗性愈伤组织与转基因植株未成熟种子胚乳中的GUS酶活性。结果表明与在非糯性的籼稻和粳稻中一样 ,这两种嵌合质粒在不合成直链淀粉的糯稻中也有相当水平的表达。从此结果可以推测 ,糯稻品种有从嵌合基因的转录本中剪接蜡质基因第 1内含子的正常能力 ,而在糯稻中缺乏直链淀粉可能是糯稻蜡质基因第1内含子中的其它突变所造成的     

比格犬MC4R基因多态性与体重相关性的研究

为了分析比格犬黑素皮质素受体-4基因多态性与犬体重的关系, 根据犬MC4R基因DNA外显子序列, 设计MC4R基因特异PCR引物1对, 犬DNA经PCR扩增, 克隆和测序, 寻找和确定犬MC4R基因的多态性位点, 分析多态性与犬体重的关系。结果在比格犬MC4R基因中发现2处单碱基缺失突变, 1个单碱基颠换变异, 存在Psh AⅠ酶切位点, 并基于PshAⅠ酶切位点建立了PCR-RFLP技术。统计分析显示犬MC4R基因型与体重显著相关, 可以考虑将MC4R基因作为犬体重的候选基因。     

应用CRISPR/Cas9技术创制低直链淀粉含量水稻种质

Wx基因直接控制水稻胚乳直链淀粉的合成,进而影响胶稠度等多个品质指标,是控制稻米食味的主效基因.适当降低稻米的直链淀粉含量可改善稻米品质.吉丰B是籼型优质杂交稻保持系,直链淀粉含量偏高,影响组配后代的食味品质.本研究以吉丰B为试验材料,对Wx基因编码区上游序列进行编辑,以期获得Wx基因表达下调,直链淀粉含量降低的水稻种...     

优质稻米‘青香软粳’低直链淀粉含量形成分子机制的初步研究

Waxy（Wx）基因在调控直链淀粉含量形成过程中起着重要的作用,是稻米蒸煮食味品质的一个关键决定因素。在本项研究中,我们以直链淀粉含量为8.7%和10.2%的优质稻品种‘青香软粳’和‘南粳46’为主要研究对象,初步分析并探讨了这两个优质稻品种稻米低直链淀粉形成的分子调控机理。结果显示,虽然都为Wx-II型粳稻品种,‘南粳46’的Wx基因在启动子1773位置存在AA/CT的变异,‘南粳46’和‘青香软粳’的Wx基因在启动子＋693位置具有G/A位点多态性。转录水平分析表明,在‘南粳46’和‘青香软粳’稻米发育过程中,Wx基因的表达模式有较大的差异,可能与其启动子序列的多态性相关,AA/CT变异处于Wx基因的转录调控区。Wx基因启动子后＋693位点的多态性与已报道Wxmq多态性位点之一相同,引起Arg158/His158的变异;生物信息学软件分析表明,该位点处于底物进入Wx蛋白催化中心的袋口上,Arg158/His158位点的变异可能影响到底物进入Wx蛋白催化活性中心的速率,从而影响稻米直链淀粉的合成过程和含量。文章丰富了Wx基因多态性的研究,为进一步验证其核苷酸变异与稻米直链淀粉含量的相关性奠定了基础。     

籼稻和粳稻中蜡质基因座位上微卫星标记的多态性及其与直链淀粉含量的关系

稻米直链淀粉是在由蜡质基因Wx编码的颗粒结合淀粉合成酶（GBSS）的催化下合成的。最近,在Wx基因的区段内发现了一段多态性微卫星序列（CT）n。对74个非糯籼稻和粳稻材料的（CT）n多态性进行了分析,并探讨了其与直链淀粉含量之间的关系。在74个品种（系）中共发现7种（CT）n片段（Wx等位基因）,即（CT）8,（CF）10,（CT）11,（CT）16,（CT）17,（CT）18,（Ch）19。在籼粳亚种间,不同（CT）n的分布存在差异较大：在籼稻中,以（CT）11和（CT）18为主,占92．6％,另有（CT）10和（CT）8各2份,（CT）17型1份;在粳稻中,以（CT）16、（CT）17为主,共占20份材料中的90．0％。在上述74个品种（系）中,以（CT）n表示的Wx基因型对稻米直链淀粉含量的决定系数R2达0．912,也即Wx基因型差异可解释这些材料直链淀粉含量变异的91．2％。还发现6份籼稻材料Wx座位上为杂合的（CT）18／（CT）11,其中2份为推广早籼优质品种浙9248和舟优903,并对其在遗传和育种研究中的意义作了探讨。     

异源四倍体鲫鲤及其原始父母本细胞周期蛋白B基因克隆与分子遗传分析

细胞周期蛋白(cyclin)B是真核细胞周期运转中调控G2期至M期转化的关键因子.本实验根据斑马鱼细胞周期蛋白 B1基因的剪切方式,设计3对特异于金鱼和银鲫细胞周期蛋白B基因外显子区兼并引物,首次扩增出异源四倍体鲫鲤及其原始亲本红鲫和鲤鱼细胞周期蛋白B基因2条大小分别约为2.4 kb和2.1 kb的片段.测序及比对分析表明：这3种鱼的细胞周期蛋白B基因2个片段均包含8个外显子和7个内含子.内含子剪切位点符合GT/AG规则,推测细胞周期蛋白B基因2个片段可能是细胞周期蛋白B基因的2种存在形式.异源四倍体鲫鲤与其原始父母本细胞周期蛋白B基因片段序列的比较结果表明：无论是外显子区还是内含子区,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本都具有较高的遗传相似性,在1 025 bp的外显子序列中相同的碱基位点数达963个,为异源四倍体鲫鲤来源于红鲫和鲤鱼提供了分子证据;同时,异源四倍体鲫鲤与其原始亲本差异碱基位点的存在又表明这一独特的多倍体物种与其原始亲本存在着进化上的变异.此外,还分别以细胞周期蛋白B基因外显子和内含子序列构建了包括异源四倍体鲫鲤及其原始父母本在内的系统进化树.结果初步表明：对于亲缘关系较近的物种,用外显子和内含子序列构建的系统进化树与传统的物种进化树一致;而对于亲缘关系较远的物种,用内含子序列构建的进化树与传统的物种进化顺序存在较大差异.     

粳稻支链淀粉合成相关基因的遗传组成及其对品质的影响

摘要：淀粉的组成和结构是决定稻米品质的主要因素。利用17个淀粉合成相关基因位点的分子标记鉴定67个粳稻品种的淀粉合成相关基因的籼粳来源,检测表明67个品种均带粳型Wx基因,GBSSⅡ、SSⅡ-2和SSⅣ-1位点没有发生重组,其他13个支链淀粉合成相关基因位点有籼型等位基因的渗入,渗入频率在1.9%-46.27%之间,其中SSⅠ籼型等位基因渗入到粳稻品种中最高;逐步回归分析表明有7个基因对10个淀粉理化指标有效应,其中Isa对最高粘度、崩解值、回复值、消减值和峰值时间有效应,其它基因只对1-4个性状有明显的遗传效应。说明在支链淀粉合成相关基因座上籼粳等位基因已经发生了明显的分化,具有不同的遗传功能,为水稻优质品种培育提供了参考依据。     

Selection under domestication: evidence for a sweep in the rice waxy genomic region

Rice (Oryza sativa) was cultivated by Asian Neolithic farmers >11,000 years ago, and different cultures have selected for divergent starch qualities in the rice grain during and after the domestication process. An intron 1 splice donor site mutation of the Waxy gene is responsible for the absence of amylose in glutinous rice varieties. This mutation appears to have also played an important role in the origin of low amylose, nonglutinous temperate japonica rice varieties, which form a primary component of Northeast Asian cuisines. Waxy DNA sequence analyses indicate that the splice donor mutation is prevalent in temperate japonica rice varieties, but rare or absent in tropical japonica, indica, aus, and aromatic varieties. Sequence analysis across a 500-kb genomic region centered on Waxy reveals patterns consistent with a selective sweep in the temperate japonicas associated with the mutation. The size of the selective sweep (>250 kb) indicates very strong selection in this region, with an inferred selection coefficient that is higher than similar estimates from maize domestication genes or wild species. These findings demonstrate that selection pressures associated with crop domestication regimes can exceed by one to two orders of magnitude those observed for genes under even strong selection in natural systems.     

Introduction of Wx transgene into rice wx mutants leads to both high- and low-amylose rice

The Waxy (Wx) gene encodes a granule-bound starch synthase (GBSS) that plays a key role in the amylose synthesis of rice and other plant species. Two functional Wx alleles of rice exist: Wx(a), which produces a large amount of amylose, and Wx(b), which produces a smaller amount of amylose because of the mutation at the 5' splice site of intron 1. Wx(b) is largely distributed in Japonica cultivars, and high amylose cultivars do not exist in Japonica cultivars. We introduced the cloned Wx(a) cDNA into null-mutant Japonica rice (wx). The amylose contents of these transgenic plants were 6-11% higher than that of the original cultivar, Labelle, which carries the Wx(a) allele, although the levels of the Wx protein in the transgenic rice were equal to those of cv. Labelle. We also observed a gene-dosage effect of the Wx(a) transgene on Wx protein expression, but a smaller dosage effect was observed in amylose production with over 40% of amylose content in transgenic rice. Moreover, one transgenic line carrying eleven copies of the transgene showed low levels of Wx expression and amylose in the endosperm. This suggested that the integration of excessive copies of the transgene might lead to gene silencing.     

Comparison of Waxy gene regulation in the endosperm and pollen in Oryza sativa L

The Waxy (Wx) gene controls amylose synthesis in rice (Oryza sativa) and its expression is regulated organ-specifically. The Wx gene is expressed in the endosperm and pollen but not in other organs. In order to know whether Wx gene regulation is the same in the endosperm and pollen, we compared expression patterns of the rice Wx gene in these two organs by immunoblot analysis. We focused on the allelic differences (Wxa and Wxb), cool temperature response and effects of the mutation at the du loci. The results obtained are as follows. First, the quantitative regulation depending on two alleles, Wxa and Wxb, was common to both organs; Wx protein levels from the Wxa allele were about 10-fold higher than those from the Wxb allele in the pollen as well as in the endosperm. Second, in both the endosperm and pollen, expression of the Wxb gene, but not the Wxa gene, was enhanced in response to cool temperature. In contrast to these two types of regulation, analysis of two du mutants, 2035 (du1) and 76-3 (du2), revealed that the pattern of reduction in Wx protein levels in the pollen was distinct from that in the endosperm, suggesting that functions of the two du+ genes differ in these two organs.     

转反义Wx基因水稻颖果中与淀粉合成和积累相关酶活性的变化

将反义Wx基因转入水稻,导致Wx蛋白不同程度减少,颖果中的直链淀粉含量不同程度下降,总淀粉含量显著降低,直链淀粉与总淀粉的比值极显著降低。在水稻颖果发育过程中,ADPG-PPase、GBSS、SSS和SBE的活性在灌浆前期迅速升高,达最大值后很快下降,在灌浆中后期下降趋缓。Wx蛋白减少后的转基因水稻颖果中的GBSS活性明显下降,下降幅度与直链淀粉含量相一致,而且活性高峰期比其亲本有所提前。转基因水稻颖果中ADPG-PPase和SSS的活性在颖果发育的前中期,SBE则在中后期高于相应的亲本。     

云南地方稻waxy基因序列多样性分析

利用特异引物Wx-F/AG-2对来源于云南省16个州市64个县的252份地方稻种waxy基因中含有微卫星序列(CT)n和第一内含子的序列进行PCR扩增并测序。结果表明在268个碱基的序列内检测到4个变异位点:第一内含子上游56位处(CT)n存在(CT)10、(CT)11、(CT)12、(CT)14、(CT)16、(CT)17、(CT)18、(CT)19、(CT)20、(CT)21等10种变异;(CT)11、(CT)18、(CT)17、(CT)12、(CT)10等5种单倍型是云南优势类型,合计占供试材料的92.85%;籼稻以(CT)10、(CT)11、(CT)12为主,而粳稻以(CT)11、(CT)12、(CT)17和(CT)18为主;第一内含子+1位存在G/T变异,81.75%品种是G,T只出现在(CT)16、(CT)17、(CT)18和(CT)20的品种中,其频率在籼稻中为13.48%,粳稻20.86%,水稻16.17%,陆稻22.35%,粘稻10.47%,糯稻42.62%。+86-88位存在ATA/GTA/A--3种变异;+128位处存在(AATT)5和(AATT)6 2种变异。根据这4个变异位点,可将252个云南地方稻种归为16种单倍型,其中Wx4(32.54%)、Wx9(13.89%)、Wx12(12.7%)、Wx5(12.3%)、Wx1(8.33%)、Wx11(7.94%)是主要类型,合计87.7%,其他类型频率较低。籼/粳亚种、水/陆稻和粘/糯中存在单倍型种类和单倍型频率两方面的差异,籼稻/粳稻、水/陆稻和粘/糯稻各亚种或生态型均有独享的单倍型,共享单倍型频率也存在差异,表明亚种间或生态型间发生了一定的遗传分化。单倍型地理分布分析表明,临沧、普洱单倍型种类最丰富,以之为中心向外扩展,单倍型种类有减少的趋势,第一内含子+1位的T主要分布在临沧、普洱、西双版纳、德宏等南部地区。本研究揭示了云南地方稻种群体waxy基因的变异和分布特点。