卡伍尔氏链霉菌NA4突变株〖WTHX〗ΔbafAI的次级代谢产物研究

链霉菌产生的次级代谢产物是农用和医药抗生素的重要来源。为了更深入挖掘卡伍尔氏链霉菌NA4潜在多样的次级代谢产物,对阻断NA4主产物bafilomycins的突变株ΔbafAI随机激活的代谢产物进行分离和鉴定。采用HP20固相萃取、硅胶柱色谱、凝胶柱色谱以及半制备HPLC等方法对ΔbafAI代谢产物进行分离纯化;使用NMR和MS确定化合物结构,并对单体化合物进行了生物活性测定。共分离鉴定6个化合物：环（L-异亮氨酸-L-脯氨酸）（1）、环（L-缬氨酸-L-脯氨酸）（2）、环（L-脯氨酸-L-亮氨酸）（3）、环（L-脯氨酸-L-苯丙氨酸）（4）、（2E, 4E）-5-（3-羟苯基）-戊-2, 4-二烯酰胺（5）和5′-脱氧-5′-甲硫肌苷（6）。6个化合物均是阻断NA4主产物后非特异激活的或产量显著提高的化合物,均为该菌中首次分离;化合物5和6是第二次从天然提取物中分离得到;化合物1和2显示出抗白色念珠菌活性,并首次报道了化合物5的抗氧化活性。进一步丰富了卡伍尔氏链霉菌NA4次级代谢产物研究,为激活沉默或低表达次级代谢产物合成基因簇提供了有益借鉴。     

Nonomuraea candida HMC10T中新结构套索肽noncaromin生物合成基因簇的克隆及异源表达

【目的】本研究旨在通过定向克隆菌株Nonomuraea candida HMC10^T中一个新的Ⅱ型套索肽类生物合成基因簇,通过在放线菌底盘宿主中的异源表达,获得新结构套索肽noncaromin,并完成其抑菌活性分析。【方法】通过antiSMASH软件分析菌株N.candida HMC10^T全基因组序列,确定新的Ⅱ型套索肽noncaromin的生物合成基因簇(biosynthetic gene cluster of noncaromin,nonc-BGC)。然后,利用ExoCET重组技术(exonuclease combined with RecET recombination)获得完整的nonc-BGC,得到重组质粒pJQK652,并通过λ-Red重组技术改造得到整合型质粒pJQK653。采用接合转移方法,将该质粒分别导入白色链霉菌、2株变铅青链霉菌、2株天蓝色链霉菌和红色糖多孢菌宿主中进行异源表达,再通过发酵和分离纯化获得目标套索肽noncaromin。最后,利用QTOF-ESI-MS²完成套索肽noncaromin的结构鉴定,并通过抗菌活性检测确定该化合物的生物活性。【结果】本研究利用ExoCET技术成功获得了完整的nonc-BGC,在6种放线菌宿主中成功异源表达,完成了noncaromin的结构鉴定,确定了其具有微弱的抗枯草芽孢杆菌活性。【结论】本研究在克隆得到新结构套索肽nonc-BGC的基础上,实现了该基因簇在6个放线菌底盘宿主中的成功表达,获得了1个具有微弱抑制枯草芽孢杆菌活性的新结构Ⅱ型套索肽noncaromin。本研究结果为发掘菌株N.candida HMC10^T及其他放线菌中的新结构化合物提供了借鉴。     

卡伍尔氏链霉菌NA4的Ⅱ型聚酮基因簇的靶向激活及其产物鉴定

【目的】以基因组信息为导向,定向激活海洋来源卡伍尔氏链霉菌（Streptomyces cavourensis） NA4中沉默的Ⅱ型聚酮类次级代谢产物生物合成基因簇,鉴定新产生的次级代谢产物的结构和抑菌活性。【方法】通过添加启动子和敲除负调控基因的方法激活实验室培养条件下沉默或低表达的生物合成基因簇,并完成目标化合物的分离与纯化,通过电喷雾质谱（electrospray ionization-mass spectrometry,ESI-MS）和核磁共振（nuclear magnetic resonance,NMR）数据分析鉴定目标化合物结构,对目标化合物进行抑菌活性鉴定,基于生物信息学信息推导化合物的生物合成途径。【结果】根据基因组生物信息学分析,从海洋来源链霉菌Streptomyces cavourensis NA4中选取一个编码PKSⅡ型次级代谢产物的生物合成基因簇开展研究,成功激活目标基因簇,从中分离到1个PKSⅡ型化合物,推导了其生物合成途径并进行了抑菌活性鉴定。【结论】基因组导向下的天然产物挖掘,可以目标明确地分离产物,充分挖掘链霉菌编码次级代谢产物的潜力。     

基于基因组的一株土壤固氮菌分离菌株鉴定及其促生作用

[目的] 为获得高效固氮菌株,充分研究利用土壤固氮菌资源。[方法] 选取固氮能力较高的紫色土发育水稻土,采用富集纯化法分离固氮微生物菌株。通过16S rRNA基因系统发育分析和全基因组相关指数比较对新分离菌株进行物种鉴定。采用乙炔还原法和¹⁵N₂示踪法定量测定新分离菌株的固氮能力,通过培养特性和接种效果初步研究固氮菌株的促生作用。[结果] 从紫色土发育水稻土中分离得到1株可在无氮培养基上快速生长的菌株P208。基于16S rRNA基因和基因组92个核心基因的系统发育分析结果表明,新分离菌株P208与Azotobacter chroococcum IAM 12666^T（=ATCC 9043^T）系统发育距离最近（16S rRNA基因相似度为99.79%）。菌株P208与A.chroococcum ATCC 9043^T的基因组平均核苷酸一致性（ANI）、平均氨基酸一致性（AAI）和数字DNA-DNA杂交值（dDDH）高于物种分类阈值（ANI>95%-96%,AAI>95%-96%,dDDH>70%）,最大唯一匹配指数（MUMi）低于物种分类阈值（<0.33）,得出新分离菌株P208为褐球固氮菌（A.chroococcum）。A.chroococcum P208固氮活性为模式菌株A.chroococcum ATCC 9043^T的2.61倍。除固氮能力外,A.chroococcum P208具有IAA生成、溶磷活性和铁载体生成等促进植物生长潜力的培养特性,室内培养条件下接种A.chroococcum P208能够促进水稻、小麦幼苗根系的生长。[结论] 从固氮能力较强的水稻土中分离纯化得到1株具有较强固氮、促生潜力的固氮菌,具有潜在的开发应用价值,可为研究利用生物固氮提供微生物资源。     

基于生物信息学分析从Streptomyces albofaciens JCM 4342中发现2,3-二羟基苯甲酸酯-L-丝氨酸脱水三聚体和二聚体天然产物

[背景] 铁是细菌生长的基本元素,而三价铁在自然水环境中几乎无法溶解。细菌已经进化出产生各种铁载体的能力,以促进铁的吸收。对于链霉菌,其特有的铁载体是去铁胺,同时它们也可以产生其他结构的铁载体,如ceolichelin、白霉素、肠杆菌素（enterobactin）和griseobactin。[目的] 揭示链霉菌中铁载体生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Clusters,BGCs）的分布特点和基因簇特征,并探索其所合成铁载体的化合物结构。[方法] 利用生物信息学工具系统地分析308个具有全基因组序列信息的链霉菌中的铁载体生物合成基因簇,并用色谱和波谱方法分离和表征肠杆菌素相关天然产物。[结果] 发现Streptomyces albofaciens JCM 4342和其他少数菌株同时含有一个缺少2,3-二羟基苯甲酸（2,3-DHB）生物合成基因的孤立的肠杆菌素生物合成基因簇和另外一个推测可合成griseobactin的基因簇。从S.albofaciens JCM 4342发酵液中鉴定出4个肠杆菌素衍生的天然产物,包括链状2,3-二羟基苯甲酸酯-l-丝氨酸（2,3-DHBS）的三聚体和二聚体以及它们的脱水产物。[结论] 2个基因簇间存在一种特别的协同生物合成机制。推测是griseobactin基因簇负责合成2,3-DHB,而孤立的肠杆菌素基因簇编码的生物合成酶可夺取该底物,进而完成上述4种肠杆菌素衍生天然产物的生物合成。     

利迪链霉菌A02抗真菌活性产物的分离和结构鉴定

利迪链霉菌A02是从京郊森林土壤中分离筛选出的植物病原真菌高效拮抗菌株。为了明确其抑菌活性的物质基础,利用大孔树脂和硅胶吸附柱层析、HPLC循环制备分离等方法,从菌株A02发酵液中分离获得了纯度达99.845%以上的单一组分活性化合物。经紫外光谱、高分辨质谱、红外光谱和核磁共振谱的测定和解析,确定了该活性化合物的分子量为665,分子式为C33H47NO13,化学结构与四烯大环内酯类抗生素纳他霉素相同。这一结果揭示了利迪链霉菌产生抗真菌天然产物的新功能,并为纳他霉素在植物病害生物防治中的应用开拓了新的途径。     

超氧化物歧化酶模拟化合物的生物活性研究

根据天然超氧化物歧化酶(SOD)活性部位结构合成了含苯并咪唑的5种配体及其32种分别含Cu（Ⅱ）、Fe（Ⅲ）、Mn（Ⅱ）、Co（Ⅱ）的模拟化合物.经光谱、电化学测试证明这些化合物具有拟S3D活性,其50％抑制率浓度（IC50）为10-6～10-8mol·L-1,催化超氧离子自由基（O-·2）歧化的反应速率常数kq为106～108mol-1·L·s-1.同时观察到几种模拟化合物有抗肿瘤活性或增强水稻抗寒性.     

喙尾琵琶甲肠道来源链霉菌(Streptomyces sp.)BPA71次级代谢产物的分离鉴定及其生物活性评价

【背景】昆虫是世界上种类最多、肠道菌群资源最丰富且多样的动物类群之一。昆虫肠道微生物具有产生活性次级代谢产物的能力,是活性天然产物的重要来源。【目的】研究药用昆虫喙尾琵琶甲(Blaps rynchopetera)成虫肠道来源链霉菌(Streptomyces sp.) BPA71的次级代谢产物及其生物活性。【方法】利用正相硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20柱色谱等方法分离纯化该菌株的发酵粗提物,采用牛津杯法进行抗菌活性追踪,确定抗菌活性部位,通过ESI-MS、NMR等波谱数据分析对化合物结构进行鉴定,采用微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),采用MTS法测定抗肿瘤活性。【结果】从Streptomyces sp. BPA71的固体发酵提取物中共分离得到4个已知化合物,通过对比核磁数据确定为糠酸甲酯(1)、吡咯甲酰胺A (2)、吡咯甲酰胺B (3)和吲哚-3-乙酸甲酯(4)。抗菌活性结果显示化合物2具有广谱抗菌活性。此外,化合物2对宫颈癌细胞HeLa、肺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC-7721、乳腺癌细胞MDA-MB-231和结肠癌细胞SW480这5株肿瘤细胞均有明显的抑制活性。【结论】喙尾琵琶甲肠道来源Streptomyces sp. BPA71可产生丰富的生物活性物质,该研究结果为进一步挖掘喙尾琵琶甲肠道链霉菌的活性天然产物奠定了基础,同时丰富了人们对喙尾琵琶甲肠道微生物的认识。     

珠江口沉积物来源链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的鉴定及其生物合成基因簇的异源表达

[目的] 从珠江口沉积物来源的菌株SCSIO 40020中分离bafilomycins,并对其生物合成基因簇进行克隆和异源表达研究。[方法] 通过分析菌株SCSIO 40020的16S rRNA基因序列并构建系统发育树以鉴定菌种,以柱层析法和制备色谱法对次级代谢产物进行分离纯化,借助波谱学手段完成单体化合物的结构鉴定,采用生物信息学分析定位bafilomycins的生物合成基因簇,通过筛选菌株SCSIO 40020基因组的细菌人工染色体文库和接合转移将bafilomycins生物合成基因簇导入3种链霉菌进行异源表达,利用高效液相色谱检测异源表达菌株的发酵产物。[结果] 菌株SCSIO 40020被鉴定为链霉菌属菌株,从其发酵产物中分离鉴定了2个单体化合物bafilomycins A₁和D。克隆了链霉菌SCSIO 40020中bafilomycins的生物合成基因簇并推导了其生物合成途径,在3种链霉菌中表达产生了bafilomycins。[结论] 从珠江口环境中获得了一株产生bafilomycins的链霉菌SCSIO 40020,成功建立了该菌株次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达体系,并首次在链霉菌Streptomyces lividans SBT18、Streptomyces coelicolor M1154和Streptomyces albus J1074中进行了表达,获得了bafilomycins,为后续bafilomycins结构类似物的生产和链霉菌SCSIO 40020中新结构活性化合物的挖掘奠定了基础。     

植物内生真菌F4a次级代谢产物的分离鉴定以及降血糖、抗氧化活性的研究

研究植物内生真菌布雷青霉菌（Penicillium brefeldianum） F4a次级代谢产物的提取分离方法、结构鉴定及其降血糖和抗氧化活性。采用液体发酵培养,大孔吸附树脂HP20提取后,经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶柱色谱、ODS反相开放柱色谱和高效液相色谱等手段进行分离,应用核磁共振等技术进行结构鉴定;采用紫外分光光度吸收法进行降血糖和抗氧化活性筛选。结果表明,分离得到6个化合物,分别鉴定为环（L-色氨酸-L-脯氨酸）（1）、3,3′-Methylenebis（4-hydroxy-6-methyl-2H-pyran-2-one）（2）、2-（2′S-Hydroxypropyl）-5-methyl-7-hydroxychromone（3）、染料木素（4）、大豆素（5）和苯酚（6）。化合物1和2具有一定的抗氧化活性,化合物4和5具有较强的抗氧化活性和降血糖活性。化合物2和3为首次从青霉属真菌中分离得到。化合物1和2的ABTS自由基清除活性为首次报道。     

Improved production of pristinamycin coupled with an adsorbent resin in fermentation by Streptomyces pristinaespiralis

Batch fermentation by Streptomyces pristinaespiralis with the addition of adsorbent resins was used to increase the production of pristinamycin. In consideration of the adsorption capacity and the desorption ability, a polymeric resin, JD-1, was finally selected. The maximum production of pristinamycin in Erlenmeyer flasks went up to 1.13 from 0.4 g l⁻¹, by adding 12% (w/v) resin JD-1 into the culture broth at 20 h after inoculation. In a 3 l bioreactor, pristinamycin fermentation with the addition of 12% (w/v) resin JD-1 at 20 h after inoculation reached 0.8 g l⁻¹, which was a 1.25-fold increase over fermentation without resin.     

杀线虫芽孢杆菌发酵条件优化及大孔树脂筛选

芽孢杆菌 SMrs28分离自草原毒草瑞香狼毒根际土壤,其代谢产物有明显的线虫触杀活性。为了确定该菌株的最优发酵条件及初步纯化活性成分的树脂类型,采用单因素试验对发酵条件进行优化,通过静态吸附试验对大孔树脂类型进行筛选。结果表明: SMrs28菌株的最优发酵条件为:以葡萄糖和酵母粉作为最佳碳源和氮源,发酵时间48 h,接种量10%,温度28 ℃,转速180 r·min^-1,150 mL的三角瓶装液量30 mL,初始pH 7.2。静态吸附试验表明,大孔吸附树脂D101对发酵液中活性成分的吸附和解吸效果显著优于XAD-4、HP20和AB-8,其解吸液的杀线虫活性明显提高。发酵条件的优化和大孔吸附树脂的筛选,明显提高了发酵液的杀线虫活性,为进一步分离纯化该菌株的活性成分奠定了基础,为微生物杀线虫剂的开发和应用提供了理论依据。     

链霉菌IMS002的分类鉴定及其抗真菌活性物质解析

【目的】对一株分离自植物根际土壤的具有抗真菌活性的链霉菌IMS002进行菌株分类鉴定,通过活性追踪分离纯化并鉴定有机相中的活性物质。【方法】通过16S rDNA和5个不同基因(atpD,gyrB,recA,rpoB,trpB)串联聚类分析以及生理生化实验分析,对链霉菌IMS002进行菌株分类鉴定,用扫描电子显微镜观察该株链霉菌的菌丝及孢子形态,以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为指示菌进行生物活性追踪,通过硅胶柱层析、凝胶柱层析及高压液相色谱(HPLC)对活性物质进行分离和纯化,使用液质联用高分辨质谱仪、500 MHz核磁共振波谱仪以及圆二色光谱仪确定该物质的化学结构。【结果】IMS002经初步鉴定与产二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)具有较近的亲缘关系,其发酵液对尖孢镰刀菌具有良好的抑菌效果,经分离和纯化以及现代波谱技术分析,确定有机相中的抑菌活性组分为Borrelidin。【结论】链霉菌IMS002能够产生化合物Borrelidin,该化合物对尖孢镰刀菌具有抑制活性。     

Isolation of nonactic acids fromStreptomyces griseus fermentation broth by thin-layer and high-performance liquid chromatography

Nonactic acid, homononactic acid and their 2-diastereoisomers were isolated by thin-layer chromatography on silica gel and by high-performance liquid chromatography on a reversed phase from the fermentation broth ofStreptomyces griseus, and identified by¹H and¹³C NMR spectroscopy.     

大孔树脂提取链霉菌4903菌株除草活性物质的研究

化感活性物质的提取方法是研究化感作用的重要步骤,对化感链霉菌4903的前期研究证明其具有抑菌及除草活性。本文选用了4种大孔吸附树脂(X-5, NKA-II, AB-8和HP-20)对化感链霉菌4903发酵液的除草活性物质进行提取。实验结果显示:树脂AB-8对链霉菌4903菌株发酵液除草活性成分具有较好的吸附性能和较易被解吸的特性,树脂AB-8对链霉菌4903菌株发酵液的静态吸附量约可达到树脂体积的7倍。用树脂2-3倍体积的80%乙醇溶液则可以把吸附的除草活性物质全部从树脂中解吸出来。AB-8适合用于链霉菌4903菌株发酵液除草活性物质的提取和纯化。     

Isolation of Possible Intermediate of Chlorogenic Acid Biosynthesis in Sweet Potato Root Tissue

Thienodolin, a new plant growth-regulating substance, was isolated from the fermentation broth of a streptomycete strain identified as Streptomyces albogriseolus.

The active principle was extracted with ethyl acetate and purified by silica gel column chromatography and preparative HPLC. The substance showed growth promoting activity with 1.2 × 10^?6–1.2 × 10^?5 M treatment to rice seedlings, and inhibitory activity with 4.0 × 10^?5 M treatment.     

星海链霉菌抑菌活性物质的分离纯化

星海链霉菌(Streptomyces xinghaiensis)是从大连星海湾海泥样品中分离的海洋链霉菌新种,其发酵液具有广谱抗菌活性。研究该菌株的发酵液对临床分离的耐药菌的抑制活性,发现星海链霉菌发酵液对鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株具有抑制活性。采用SPE、大孔吸附树脂HP-20、葡聚糖凝胶Sephadex LH-20、HPLC、TLC等对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的物质进行了活性追踪,发现活性物质为弱碱性水溶性成分,无特征紫外吸收,可被茚三酮显色,推断活性物质可能为氨基糖苷类化合物。对星海链霉菌基因组序列进行初步分析,发现一个与核糖霉素生物合成基因簇相似性较高的基因簇,但TLC分析结果表明,活性化合物与核糖霉素不同。     

链霉菌FIM-080014产生的核苷类代谢产物研究

本文采用大孔吸附树脂、硅胶柱色谱、反相柱色谱、凝胶sephadex LH-20及HPLC等方法对链霉菌FIM-080014发酵液及菌丝体中的代谢产物进行分离,得到7个核苷类化合物。通过NMR及MS等方法鉴定了上述化合物的结构,分别为尿嘧啶(1)、尿嘧啶核苷(2)、2'-脱氧尿嘧啶核苷(3)、5'-C-甲基尿嘧啶核苷(4)、2'-脱氧胸腺嘧啶核苷(5)、2'-脱氧鸟嘌呤核苷(6)和次黄嘌呤(7),其中化合物4首次从微生物代谢产物中分离得到。活性分析表明化合物1～7对神经氨酸酶具有一定的抑制活性,其IC50值分别为3.7、2.1、4.4、1.4、3.6、2.5和2.4 mM。     

Isolation and characterization of pcsB, the gene for a polyene carboxamide synthase that tailors pimaricin into AB-400

From cell-free extracts of Streptomyces RGU5.3, a tailoring activity of pimaricin, leading to the biosynthesis of its natural carboxamide derivative AB-400, was recently identified. The two polyene macrolides, pimaricin and AB-400, were produced in almost equal quantities and can be detected in the fermentation broth of the producer strain. This report concerns the isolation and partial characterization of the gene, polyene carboxamide synthase (pcsB), responsible for the bioconversion. The gene encoded an asparagine synthase-like protein, belonging to the type II glutamine amidotransferase family, and was named pcsB. The fermentation broth of a recombinant strain carrying the engineered pcsB gene under the control of the inducible tipA promoter within an integrative vector produces the carboxamide AB-400 as the main polyene macrolide.